异硫氰酸苯乙酯通过PI3K-NF-κB-MMP-9途径抑制结肠癌SW480 细胞的迁移和侵袭

魏付桥，谢文彪*，申清香，刘昌化，罗康宁

(南华大学 附属第二医院 1.胃肠外科； 2.妇产科, 湖南 衡阳 421001)

异硫氰酸苯乙酯通过PI3K-NF-κB-MMP-9途径抑制结肠癌SW480 细胞的迁移和侵袭

魏付桥1，谢文彪1*，申清香2，刘昌化1，罗康宁1

(南华大学 附属第二医院 1.胃肠外科； 2.妇产科, 湖南 衡阳 421001)

目的观察异硫氰酸苯乙酯(PEITC)对结肠癌细胞SW480增殖侵袭的分子机制。方法体外培养结肠癌细胞系SW480，分别用10，30和50 μmol/L PEITC作用24 h，MTT法检测细胞的增殖；伤口愈合实验和侵袭实验分别检测PEITC对SW480细胞迁移与侵袭的影响。荧光共振能量转移法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的活性，RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达情况；Western blot检测PI3K和PTEN的表达和Akt、mTOR磷酸化，以及NF-κB核转位情况。荧光素酶报告基因分析NF-κB的活性。最后，建立裸鼠异种移植瘤动物模型，观察PEITC对异种移植瘤生长的抑制作用。结果PEITC能在不影响细胞活性的条件下显著抑制SW480细胞侵袭和迁移(Plt;0.05)，也能抑制MMP-9的酶活性以及mRNA表达(Plt;0.05)。同时PEITC能抑制PI3K的表达以及抑制Akt和mTOR磷酸化(Plt;0.05)，上调PTEN表达。PEITC也能抑制NF-κB核转位，并能降低其活性(Plt;0.05)。此外，PEITC也能抑制裸鼠异种移植瘤的生长(Plt;0.05)。结论PEITC是一种潜在的抗结肠癌细胞转移药物，它可能通过影响PI3K/Akt和NF-κB通路发挥作用。

异硫氰酸苯乙酯；SW480细胞；基质金属蛋白酶9；PI3K/Akt；核转录因子κB

结肠癌是胃肠外科最常见的恶性肿瘤。据统计，全世界每年新发病例可达120万人以上。和其他恶性肿瘤一样，90%以上结肠癌患者死于癌细胞的侵袭和转移[1- 3]。在此过程中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)介导的细胞外基质(extracellular matrix ECM)降解中发挥重要作用[4]。在所有的MMPs中，以MMP-9(明胶酶B)最重要。因此以MMP-9为治疗靶点，对结肠癌的治疗具有重要意义。

异硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate, PEITC)异硫氰酸脂的一种，广泛存在于橄榄，花椰菜等十字花科植物当中。研究显示，PEITC可与β-微管蛋白结合，促进微管蛋白的稳定而使细胞阻滞于G2/M期[5]。同时，PEITC也能抑制去乙酰化酶的活性[6]。此外，体内外毒性实验显示PEITC对正常组织细胞无明显的不良反应[7]。尽管如此，但PEITC能否影响结肠癌细胞的迁移与侵袭，目前仍不完全清楚。本研究旨在观察PEITC对结肠癌SW480细胞的迁移与侵袭有何影响，并探讨其可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

6～8周龄的SPF级BALB/c(nu/nu)雄性裸鼠(体质量16～18 g，南华大学动物部，批号：20120302)；PEITC(LKT Laboratories，纯度≥95%)，并用二甲基亚砜(DMSO)溶解；细胞培养基和Trizol(Invitrogen公司)、培养板和Transwell小室(Corning公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；MMP-9活性检测试剂盒(AnaSpec公司)；细胞蛋白提取试剂盒(Thermo)；抗P65，P85，α-tublin、PARP和PTEN(Santa Cruz)；磷酸化Akt，总Akt以及磷酸化mTOR和总TOR(Cell Signaling公司)；ECl化学发光试剂盒(Amersham Pharmacia公司)；NF-κB荧光素酶报告基因(SABioscicence公司)；双重荧光素酶实验系统(Promega公司)；DNA转染试剂(Roche公司)。

1.2 细胞培养及活性检测

SW480细胞系(中南大学肿瘤研究所)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃，5% CO2条件下培养。分别设立对照组(加入等体积的DMSO)及不同浓度PEITC处理组(加入终浓度为10、30和50 μmol/L的PEITC作用24 h)。采用MTT观察PEITC对SW480细胞的增殖情况，即，SW480孵育结束后，每孔加入30 μL噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)溶液(1 g/L)孵育2 h。弃上清，并加入200 μL DMSO，充分混匀，用酶标仪测定各孔的吸光度值(A570)，并计算抑制率。抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.3 MMP-9活性测定

细胞处理结束后，获取上清，采用间接法测定MMP-9的酶活性。其步骤根据试剂盒提供的步骤进行。根据荧光酶标仪上测定的荧光强度(与MMP-9的活性成正比，激发/发射波长分别为340 nm和490 nm)，并计算各组与对照组的比值(相对活性)。

1.4 RT-PCR检测MMP-9 mRNA表达

采用Trizol提取RNA，并根据试剂盒提供的步骤进行RT-PCR。PCR反应条件如下：94 ℃ 变性30 s，65 ℃(MMP-9)或59 ℃(GAPDH) 30 s，72 ℃延伸30 s。随后进入40(MMP-9)或35(GAPHD)个扩增循环。其中MMP-9引物分别为5′-CGCTACC ACCTCGAACTTTG-3′和5′-GCCATTCACGTCGTCCT TAT-3′，产物196 bp。GAPDH：5′TCACCATCTTCCA GGAGCGA-3′，5′-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3′，产物700 bp。扩增产物随后经2%琼脂糖凝胶电泳，并采用Image J软件进行灰度分析。

1.5 伤口愈合实验

通过伤口愈合实验测定细胞的迁移能力。即5×106个细胞接种于6孔板中37 ℃培养6 h。待细胞呈单层贴壁生长后，用用200 μL的移液管尖端在板上划痕。PBS洗涤后加入含有PEITC的完全培养基孵育24 h。在显微镜下拍照并计算迁移率：(1-处理后划痕距离/对照组划痕距离)×100%。

1.6 侵袭性实验

将基质胶均匀铺至Transwell小室上室，并加入100 μL细胞悬液(106/ml)，下室加入500 μL完全培养基，37 ℃孵育24 h。取出Transwell，多聚甲醛固定，风干后加入0.1%结晶紫染色20 min。擦除上室细胞，显微镜下随机选择视野拍照，计算迁移到下腔表面的细胞数。其中侵袭抑制率=(1-样本穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数)×100%。

1.7 Western blot以及 NF-кB核转位分析

根据试剂盒提供的步骤提细胞总蛋白或核蛋白，并测定其浓度。获取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分离的总蛋白或核蛋白随后转印至PVDF膜上(Millipore)，并利用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，随后加入一抗抗体4 ℃孵育过夜。多次洗涤之后，加入HRP标记的二抗孵育膜1 h。ECL发光、显影。

1.8 NF-κB荧光素酶报告基因实验

用x-tremeGENE HP DNA转染试剂将NF-κB荧光素酶报告基因转染至SW480细胞中。18 h后，细胞加入不同浓度PEITC作用2 h，根据双荧光素酶检测系统于光度计下检测荧光素酶活性(BMG Lebtech)。

1.9 异种移植瘤动物模型的建立及处理

获取对数生长期的 SW480 细胞，在每只裸鼠右腋皮下接种 0.2 mL细胞悬液(细胞量约5×106个)，接种后置于SPF环境饲养。每2～3日测量皮下肿瘤直径，待肿瘤直径为 0.5～0.6 cm 时，按每克体重每2天灌胃给予0.5，1和5 μmol PEITC，共7次。接种后的小鼠自由进食、饮水。最后1次灌胃20 d后测量小鼠体质量以及肿块质量，计算抑瘤率(%)=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 PEITC抑制SW480细胞的迁移和侵袭

10，30和50 μmol/L PEITC处理SW480细胞后，细胞迁移率分显著低于对照组(Plt;0.05)(图1A，表1)。不同浓度的PEITC也能呈剂量依赖性方式抑制SW480细胞侵袭(Plt;0.05)(图1B，表1)。

A.migration (×10)；B.invasion (×20)图1 PEITC抑制SW480细胞迁移与侵袭Fig 1 PEITC reduces SW480 cells migration and invasion

表1 PEITC抑制SW480细胞迁移与侵袭Table 1 PEITC reduces SW480 cells migration and

*Plt;0.05 compared with control.

2.2PEITC抑制SW480细胞MMP-9的表达mRNA并抑制其酶活性

SW480细胞未处理前，MMP-9 mRNA表达水平较高，经不同浓度PEITC处理后，其mRNA水平随着浓度的增高而降低(图2)。

A：The mRNA was determined by RT-PCR analysis；B：Enzymic activity analysis of MMP-9; 1.control; 2.10 μmol/L PEITC；3.30 μmol/L PEITC；4.50 μmol/L PEITC; *Plt;0.05 compared with control图2 PEITC抑制MMP-9 mRNA表达及其酶活性Fig 2 PEITC down-regulates the mRNA expression and enzymic activity of MMP-9

2.3 PEITC抑制SW480细胞中PI3K/AKT通路

PEITC处理后，SW480细胞中PI3K(P85)水平(图3A)，磷酸化Akt以及磷酸化mTOR水平明显降低(图3B，C)，而总Akt和mTOR无明显影响。此外，PEITC能上调SW480细胞中PTEN水平(图3D)。

图3 PEITC对SW480细胞中PI3K/AKT通路的影响Fig 3 Effect of PEITC on PI3K/AKT pathways in SW480 cells

2.4 PEITC抑制SW480细胞NF-κB的活性

10～50 μmol/L PEITC处理后，能显著抑制SW480细胞中NF-κB P65亚基转位至细胞核内(图4A)。10 μmol/L PEITC即可影响NF-κB的转录活性，50 μmol/L时其活性降低了42%(图4B)。

A.Western blot analysis of P65 nuclear translocation；B.luciferase activity of NF-κB; 1.control; 2.10 μmol/L PEITC；3.30 μmol/L PEITC；4.50 μmol/L PEITC; *Plt;0.05 compared with control图4 PEITC抑制SW480细胞NF-κB活性Fig 4 PEITC blocks the NF-κB pathway in SW480 cells

2.6 PEITC对裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用

不同剂量PEITC可显著BALB/c裸鼠异种移植瘤的生长。随着PEITC剂量的增加，肿瘤重量随之降低，对实体瘤生长的抑制率随之增高(表2)。

表2 PEITC对异种移植瘤生长的影响Table 2 Effect of PEITC on growth in xenograft

*Plt;0.05 compared with control.

3 讨论

肿瘤细胞侵袭性生长过程中，蛋白水解酶(如MMP-9)降解ECM蛋白是癌细胞侵袭和转移发生的关键。有研究显示PEITC能抑制前列腺癌、乳腺癌以及肺癌细胞肺转移[8- 9]，然而，PEITC对结肠癌的抑制作用尚未完全清楚，本研究证实PEITC在无细胞毒性的浓度范围内能明显抑制SW480细胞的侵袭和转移，减少细胞黏附到基质膜，并能明显抑制明胶酶活性和MMP-9的表达，最终抑制肿瘤生长。这表明PEITC在结肠癌中通过抑制MMP-9的表达和活性而具有抗侵袭的潜能。

PI3K是一种脂质激酶，通过激活Akt(蛋白激酶B)控制多种生理过程，它通过诱导P21WAF1定位于细胞质，并通过灭活前凋亡因子BAD和caspase-9发挥抗凋亡作用，此外，活化的Akt可通过诱导MMPs的表达而促进癌细胞侵袭和转移[10]。mTOR是Akt所调控的下游靶分子之一。mTOR通过诱导分泌MMP-2和MMP-9而导致ECM重构而促进肿瘤细胞转移[11]。PTEN是一个具有双重特异性的脂质磷酸酶，通过负调控PI3K/AKT通路而抑制AKT的活性。研究显示， MMP-9 mRNA含量与PI3K/AKT/mTOR通路相关，而与PTEN成负相关[12]。本研究也证实，PEITC能增加PTEN的表达，同时也能抑制PI3K(P85)通路和Akt和 mTOR的磷酸化。NF-κB是Akt下游通路的重要靶分子。并参与调控MMP-9的表达，并与炎性反应、肿瘤细胞增殖、侵袭和转移密切相关[13]。此外，NF-κB在多种肿瘤细胞中持续激活，并诱导多种抗凋亡蛋白表达而导致化疗/放疗耐受[14]。因此抑制NF-κB的活性可能有利于提高药物的疗效。本研究结果显示，PEITC可有效抑制NF-κB转录活性，并能抑制其核转位。由于MMP-9的启动子区域存在NF-κB的结合位点[15]，因此PEITC对NF-κB活性的抑制作用，可能是其下调MMP-9表达的原因。

总之，本研究证明PEITC具有抑制SW480细胞侵袭以及实体瘤生长的能力。其机制可能通过上调PTEN表达、抑制PI3K/Akt通路以及NF-κB的活性而抑制MMP-9活性和表达。由于PEITC来源于可食用天然植物，这无疑为肿瘤的预防和治疗提供了重要参考，即，长期食用PEITC含量丰富的蔬菜可降低肿瘤发生的风险，此外，PEITC有望成为结肠癌的重要辅助治疗药物。

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Phenethyl isothiocyanate inhibits human colon cancer SW480 cells migration and invasion by PI3K-NF-κB-MMP-9 pathway

WEI Fu-qiao1, XIE Wen-biao1*, SHEN Qing-xiang2, LIU Chang-hua1, LUO Kang-ning1

(1.Dept. of Gastrointestinal Surgery; 2.Dept. of Gynaecology and Obstetrics, the Second Affiliated Hospital of Nanhua University, Hengyang 421001, China)

ObjectiveTo investigate the anti-invasive mechanisms of phenethyl isothiocyanate(PEITC) in human colon cancer SW480 cells.MethodsHuman colon cancer SW480 cell line was cultured, and treated with 10, 30,50 μmol/L PEITC for 24 h. Cell viability, cell migration and invasion were analyzed by MTT assay, scratch healing assay and transwell membrane assay. Activity of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) was analyzed by a fluorescence resonance energy transfer kits, and MMP-9 mRNA expression was detected by RT-PCR. Activation of phosphoinisitide-3-kinase (PI3K) /Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR) and phosphatase and tensin homologue (PTEN), and nuclear translocation of nuclear factor kappa B (NF-κB) were examined by Western blot. NF-κB activity was detected by luciferase reporter assay. Furthermore, a mice model with xenograft tumors was constructed,and the effect of PEITC on tumor growth was analyzed.ResultsPEITC significantly reduced SW480 cells invasion and migration without affecting the viability of cells (Plt;0.05). PEITC also markedly inhibited MMP-9 activity and expression at both protein and mRNA levels (Plt;0.05). PEITC attenuated PI3K and phosphorylation of AKT and mTOR, whereas PTEN increased. In the meantime, PEITC inhibited NF-κB transcriptional activity (Plt;0.05). In addition, PEITC diminished NF-κB nuclear translocation. Furthermore, PEITC could significantly inhibit xenograft tumors growth in nude mice (Plt;0.05).ConclusionsPEITC is a potential anti-invasive agent by inhibiting MMP-9 to be involved in PI3K/AKT and NF-κB pathways.

phenethyl isothiocyanate(PEITC)；SW480 cells； MMP-9；PI3K/AKT； NF-κB

2013- 10- 25

2013- 12- 24

湖南省科技计划项目(2013SK3120)；湖南省高校科技创新团队资助项目[湘教通(2010)212号]

*通信作者(correspondingauthor)： xiewenbiao2013@sohu.com

1001-6325(2014)04-0927-06

研究论文

R739.6

A