慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制

曹稳珑，韦尉元，罗 文，张笑石，严林海，谢玉波，肖 强*

(广西医科大学 第一附属医院 1.胃肠腺体外科；2.麻醉科， 广西 南宁 530021)

慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制

曹稳珑1，韦尉元1，罗 文1，张笑石1，严林海1，谢玉波2，肖 强1*

(广西医科大学 第一附属医院 1.胃肠腺体外科；2.麻醉科， 广西 南宁 530021)

目的探索E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制。方法用携带E2F-1基因的重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞，作为实验组(LV-E2F-1-GFP组)；以对照慢病毒颗粒(LV-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞，作为阴性对照组(LV-GFP组)；空白对照组常规培养，不做任何处理。用RT-PCR和Western blot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因的表达。结果与LV-GFP组和空白对照组比较，LV-E2F-1-GFP组人胃癌MGC-803细胞Skp2、Bcl-2和survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(Plt;0.05)，Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(Plt;0.05)。结论慢病毒介导E2F-1基因过表达可能通过降低Skp2、survivin、Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达来抑制人胃癌MGC-803细胞增殖。

胃癌；MGC-803细胞；E2F-1; 过表达

在我国，胃癌的发病率及病死率均位居所有恶性肿瘤首位，每年因胃癌死亡人数约占全球胃癌病死总人数的1/4[1]。恶性肿瘤的发生发展过程涉及多基因多因素的相互作用，其中细胞凋亡的信号传导通路失调与肿瘤的侵袭、生长的关系最为密切。E2F-1作为细胞转录的重要调节因子和众多基因转录的启动子, 前期的体内外实验证实E2F-1对肿瘤的生长具有抑制作用[2-3]，但机制尚不十分明确。因此本实验通过重组慢病毒颗粒介导E2F-1基因过表达转染人胃癌MGC-803细胞，观察对凋亡相关基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin表达的影响，初步探讨E2F-1过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

含E2F-1基因过表达的重组慢病毒颗粒(Genechem公司)。兔抗人一抗HA抗体(Santa Cruz公司)，羊抗兔二抗IgG抗体(Pierce公司)。人胃癌MGC-803(中国科学院上海细胞库)。Trizol试剂(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(中国上海生工生物公司)。细胞培养基RPMI1640及胎牛血清(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与基因转染：人胃癌MGC-803细胞用含10%(体积分数)胎牛血清DMEM培养液培养，在37 ℃、5%(体积分数) 的CO2培养箱中培养。隔天细胞换液。取对数生长期细胞接种于6孔板中，3.5×104个/孔，用不含抗生素的10% DMEM培养液培养，观察待细胞汇合度达40%～60%时，按慢病毒转染说明书操作，以E2F-1基因过表达重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)和对照慢病毒颗粒(LV-GFP)分别感染人胃癌MGC-803细胞，作为实验组(LV-E2F-1-GFP组)和阴性对照组(LV-GFP组)，空白对照组细胞不做任何处理，常规培养。待细胞长满孔板，常规消化收集细胞样本，进入下一步实验。

1.2.2 RT-PCR检测人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因mRNA的表达：用Trizol法提取各组细胞的总RNA，按反转录试剂盒说明反转录获取cDNA， PCR 仪扩增。E2F-1 上游引物：5′-CCCAACTCCCTCTACCCT-3′,下游引物：5′-CTCCCATCTCATATCCATCCTG-3′，长度217 bp, 退火温度54 ℃；Skp2上游引物：5′-GCTGCTAAAGGT CTCTGGTGT-3′,下游引物：5′-AGGCTTAGATTCTGC AACTTG-3′，长度291 bp,退火温度60 ℃；Bax上游引物：5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGT-3′,下游引物：5′-CCGGAGGAAGTCCAATGTC-3′;长度269 bp,退火温度55 ℃；Bcl-2上游引物：5′-GACTTCGCCGA GATGTCCAG-3′,下游引物：5′-CATCCCAGCCTCCGT TATCC-3′，长度259 bp,退火温度62 ℃；survivin上游引物： 5′-AAATGCACTCCAGCCTCTGT-3′，下游引物：5′-TGTCGAGGAAGCTTTCAGGT-3′，长度为311 bp，退火温度60 ℃；内参GAPDH上游引物：5′-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCACCACCCT GTTGCTGTA-3′，长度为450 bp，退火温度52 ℃。反应条件：94 ℃预变性4 min；30个循环，94 ℃ 30 s,52～62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s；72 ℃延伸5 min。取3 μL PCR产物经2%非变性琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像获取图片经Quantity One 软件分析，对Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因与其内参吸光度值的比值进行半定量比较，然后在组间相互比较。

1.2.3 Western blot检测人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin蛋白的表达：使用组织裂解液提取各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。取100～125 μg蛋白在10% SDS-PAGE胶上电泳，后转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)，用TBST配制5%脱脂奶分别加入兔抗人Skp2、Bax、Bcl-2和survivin抗体(1∶1 000)，于常温孵育1.5 h；加入羊抗兔抗体IgG(1∶12 000)，常温孵育30 min，胶片曝光显影，以GAPDH为内参照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1E2F-1基因过表达对人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因mRNA表达量的影响

LV-E2F-1-GFP组Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA表达量低于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)，E2F-1和Bax的mRNA 的表达量高于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)(图1，2；表1)。

2.2E2F-1基因过表达对人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin的蛋白表达量的影响

LV-E2F-1-GFP组Skp2、Bcl-2和survivin的蛋白表达量低于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)，E2F-1和Bax的蛋白的表达量高于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)(图3，表2)。

M.500 bp marker; 1.LV-E2F-1-GFP group; 2.LV-GFP group; 3.control group图1 RT-PCR检测E2F-1、Bax和Bcl-2的mRNA表达Fig 1 RT-PCR detection of E2F-1, Bax and Bcl-2 mRNA expression

表1 各组细胞中凋亡相关基因mRNA的表达情况Table 1 The mRNA expression level of apoptosis-related genes in each group(±s, n=18)

*Plt;0.05 compared with LV-GFP group and blank control group.

表2 各组细胞中凋亡相关基因的蛋白表达情况Table 2 The protein expression level of apoptosis-related genes in each group(±s, n=18)

*Plt;0.05 compared with LV-GFP group and blank control group.

M.500 bp marker; 1.LV-E2F-1-GFP group; 2.LV-GFP group ; 3.control group图2 RT-PCR检测Skp2和survivin的mRNA表达Fig 2 RT-PCR detection of the expression of Skp2 and survivin mRNA

1.LV-E2F-1-GFP group; 2.LV-GFP group;3.control group图3 Western blot检测E2F-1、Bax、Bcl-2、Skp2和survivin蛋白的表达Fig 3 Western blot detection of E2F-1, Bax, Bcl-2, Skp2 and survivin protein expression

3 讨论

转录因子E2F-1是细胞G1期进入S期最重要的转录因子之一,调控着下游基因的表达。Skp2参与调控细胞增殖和凋亡，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关[4]。Bcl-2家族分为促凋亡亚家族和抗凋亡亚家族，而Bcl-2和Bax分别为这两个亚家族的经典代表[5-6]。Survivin是一种凋亡抑制蛋白，其具有抑制细胞凋亡和促进细胞异常增殖的作用[7]。前期研究表明，E2F-1基因过表达可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭力，促进胃癌细胞凋亡[2]；前期的体内动物实验也发现：含有转录因子E2F-1基因过表达的重组反转录病毒载体瘤内注射可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长[3]，但机制尚不明确。因此，探索E2F-1过表达对凋亡相关基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin表达的影响，研究其可能的作用机制具有重要意义。

本研究表明LV-E2F-1-GFP组Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA和蛋白的表达量显著降低，而Bax显著升高。有研究表明，Skp2表达下降，从而解除了Skp2对P27的抑制[8]，而P27基因高表达通过EGFR/PI3K/Akt信号通路可使细胞DNA合成受抑制，从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖[9]。Bcl-2编码的蛋白主要作用是保持线粒体膜的完整性, 抑制细胞色素C的释放, 从而促进细胞生存，抑制细胞凋亡[10]，而Bax蛋白可拮抗Bcl-2的保护效应从而使细胞趋于凋亡[11]。Survivin的表达水平下调使caspase-3、caspase-9和Bax在mRNA和蛋白水平上表达增加[12-13]，从而间接解除了survivin过表达对caspase-9、caspase-3、bax基因表达的抑制作用，启动了凋亡的信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡。本研究表明，E2F-1基因过表达可使人胃癌MGC-803细胞中凋亡相关基因Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA及蛋白表达水平均显著下调，基因Bax的mRNA及蛋白表达水平均上调，与前期研究E2F-1过表达可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进了胃癌细胞凋亡的结果相一致。因此，推测E2F-1过表达可通过对凋亡相关基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin产生影响从而对胃癌细胞及其移植瘤起抑制作用。

综上所述，本实验发现E2F-1过表达可抑制Skp2、Bcl-2和survivin的表达，促进Bax表达，这提示E2F-1极可能经过这些基因的信号传导通路发挥作用，引起胃癌细胞生物学行为发生改变，抑制胃癌的进展。

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The molecular mechanisms of human gastric cancer cell line MGC-803 proliferation suppressed by overexpression ofE2F-1 mediated by lentivirus

CAO Wen-long1, WEI Wei-yuan1, LUO Wen1, ZHANG Xiao-shi1, YAN Lin-hai1,XIE Yu-bo2, XIAO Qiang1*

(1.Dept. of Gastrointestinal and Gland Surgery;2.Dept. of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

ObjectiveTo study the molecular mechanisms of human gastric cancer cell line MGC-803 proliferation suppressed by overexpression ofE2F-1.MethodsThe experimental group(LV-E2F-1-GFP group),gastric cancer MGC-803 cells were transfected with recombinant lentivirirus vector (LV-E2F-1-GFP),the negative control group was transfected with negative control lentiviral vector (LV-GFP). The expression ofSkp2,Bax,Bcl-2 andsurvivinwere detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blot method.ResultsCompared with LV-GFP group and blank control group,the mRNA levels ofSkp2,Bcl-2 andsurvivinin the LV-E2F-1-GFP group were reduced significantly(Plt;0.05),the protein levels ofSkp2,Bcl-2 andsurvivinin the LV-E2F-1-GFP group were reduced(Plt;0.05), the mRNA level ofBaxand the protein level ofBaxwere up regulated (Plt;0.05).ConclusionsThe proliferation of human gastric cancer MGC-803 cells is inhibited by overexpression ofE2F-1 mediated by lentivirus, the effect may be explained with down-regulation ofSkp2,survivin,Bcl-2 expression and up-regulation ofBaxexpression.

gastric cancer ; MGC-803 cells;E2F-1;overexpression

2013-08-21

2013-11-26

国家自然科学基金(30860273)；广西科学技术攻关项目(桂科攻10124001A-22)；广西自然科学基金(2013GXNSFAA019163)

*通信作者(correspondingauthor)： xiaoqiang20050@aliyun.com

1001-6325(2014)04-0459-05

研究论文

R 735.2

A