肾透明细胞癌中CXCR4和MMP-2表达增强

李文贤，林晓杰，于 磊，刘海蕾，陈 强*

(青岛大学 医学院 附属医院 1.泌尿外科； 2.儿内科，山东 青岛 266003；3.青岛市第八人民医院 泌尿外科， 山东 青岛 266100； 4.潞安集团 总医院 泌尿外科， 山西 长治 046204)

肾透明细胞癌中CXCR4和MMP-2表达增强

李文贤1，林晓杰2，于 磊3，刘海蕾4，陈 强1*

(青岛大学 医学院 附属医院 1.泌尿外科； 2.儿内科，山东 青岛 266003；3.青岛市第八人民医院 泌尿外科， 山东 青岛 266100； 4.潞安集团 总医院 泌尿外科， 山西 长治 046204)

目的研究肾透明细胞癌(ccRCC)组织中CXC趋化因子受体4(CXCR4)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达及意义。方法用免疫组织化学PV6000和RT-PCR法联合检测88例ccRCC组织和48例正常肾组织中CXCR4和MMP-2蛋白及mRNA的表达。结果在ccRCC组织中CXCR4和MMP-2蛋白及mRNA的表达显著高于正常肾组织(Plt;0.05)；在ccRCC组织中CXCR4和MMP-2蛋白及mRNA的表达与肿瘤的临床分期、病理分级及有无淋巴结转移相关(Plt;0.05)，而与患者年龄、性别及肿瘤直径无关；在ccRCC组织中CXCR4和MMP-2的表达在蛋白水平及基因水平均呈正相关(Plt;0.05)。结论CXCR4和MMP-2可能在ccRCC的发生、发展、侵袭和转移过程中发挥协同作用，有望为ccRCC诊治提供新途径。

肾透明细胞癌；CXC趋化因子受体4；基质金属蛋白酶-2；免疫组织化学；RT-PCR

肾细胞癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的2%～3%，肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是肾癌中最常见的病理类型，约占肾癌患者的70%～80%[1]。患者早期症状往往不明显，发现时约20%～30%已发生远处转移[2]。目前肾癌的治疗以手术为主，虽然取得一定的临床效果，但转移性肾癌预后极差，5年生存率不到10%[3]。侵袭和转移是影响患者疗效和预后的主要因素，因此选择较为敏感的检测肾癌侵袭和转移的分子生物学指标对肾癌患者进行早期诊断、病情评估乃至靶向治疗至关重要。本研究探讨CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)和MMP-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)在ccRCC组织及正常肾组织中表达的相关性及与临床病理因素的关系，为ccRCC的早期诊断和病情评估提供临床参考价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

经医院伦理委员会批准及受试者知情同意，收集青岛大学医学院附属医院泌尿外科2012年7月至2013年5月手术切除的ccRCC标本。其中ccRCC组织标本88例，男63例，女25例，年龄30～79岁，平均(55.7±4.9)岁，肿瘤直径2.1～12.5 cm，平均5.2 cm。88例ccRCC标本中，根据2009年美国癌症联合会(AJCC)的TNM分期，Ⅰ期36例，Ⅱ期29例，Ⅲ期18例，Ⅳ期5例，根据1997年WHO推荐的组织学分级，高分化41例，中分化30例，低分化(未分化)17例，20例经病理证实发生淋巴结转移。正常肾组织标本48例，取自距肿瘤切缘5 cm以上的正常肾组织，作为正常对照。上述标本均经病理检查确诊，所有患者术前均未行放疗、化疗或栓塞治疗。所有标本离体后迅速分成两份，一份立即投入液氮中冻存，随后转入-80 ℃冰箱中保存；另一份经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋保存。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂：鼠抗人CXCR4单克隆抗体(Ramp;D公司)，鼠抗人MMP-2单克隆抗体和PV6000试剂盒(北京中杉金桥公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.2 免疫组化PV6000法检测组织中蛋白的表达：具体操作严格按照试剂盒说明书进行，用PBS代替一抗作阴性对照。结果由两位有经验的病理科医师双盲独立阅片得出。CXCR4和MMP-2阳性表达主要分布于细胞膜和(或)细胞质，呈棕黄或棕褐色颗粒状。根据阳性细胞率和染色强度进行评分:1)阳性细胞率:随机选取10个高倍视野进行记数,每个视野读取200个细胞，计算阳性细胞率,并取平均数。阳性率lt;5%为0分,5%～10%为1分,10%～50%为2分,gt;50%为3分。2)染色强度:无着色者为0分,轻度着色(浅黄色)为1分,中度着色(棕黄色)为2分,重度着色(棕褐色)为3分。免疫组化结果由1)+2)得出：0～2分为阴性，3～6分为阳性[4]。

1.2.3 RT-PCR法检测组织中mRNA的表达：用Trizol试剂提取组织总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书操作，获取的cDNA进行PCR扩增，同时扩增GAPDH作为内参照。应用Primer5.0软件设计引物，CXCR4：正义链5′-GCCTTATCCTGCCTGGT ATTGTC-3′，反义链5′-GCGAAGAAAGCCAGGATGA GGAT-3′，产物长度130 bp；MMP-2：正义链5′-AA CTACGATGATGACCGCAAG-3′，反义链5′-GACAGA CGGAAGTTCTTGGTG-3′，产物长度164 bp；GAPDH：正义链5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′；反义链5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，产物长度146 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，用Quantity One凝胶成像分析系统测定各电泳条带吸光度值，计算各目的基因相对表达量(目的基因相对表达量=目的基因条带吸光度值/GAPDH基因条带吸光度值)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 CXCR4和MMP-2蛋白在ccRCC组织和正常肾组织中的表达：在88例ccRCC组织中，有67例(76.1%)CXCR4阳性表达，62例(70.5%)MMP-2阳性表达，而在48例正常肾组织中，有12例(25.0%)CXCR4阳性表达，9例(18.8%)MMP-2阳性表达，CXCR4和MMP-2蛋白在ccRCC组织中表达的阳性率显著高于正常肾组织(Plt;0.05)(图1)。

图1 CXCR4(A)和MMP-2(B)蛋白在ccRCC组织中的表达Fig 1 Expression of CXCR4(A) and MMP-2(B) protein in ccRCC tissues(×200)

2.1.2 CXCR4和MMP-2蛋白的表达与ccRCC临床病理参数之间的关系：CXCR4和MMP-2蛋白表达与ccRCC的TNM临床分期、病理分级及有无淋巴结转移密切相关(Plt;0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤直径无关(表1)。

2.1.3 ccRCC组织中CXCR4和MMP-2蛋白表达的相关性分析：88例ccRCC组织中，CXCR4和MMP-2蛋白同时表达阳性者55例(62.5%)，同时表达阴性者14例(15.9%)。在ccRCC组织中CXCR4和MMP-2蛋白的表达呈显著正相关(Plt;0.05)。

2.2 RT-PCR结果

2.2.1CXCR4和MMP-2 mRNA在ccRCC和正常肾组织中的表达：CXCR4和MMP-2 mRNA在ccRCC组织中的表达分别为(0.688±0.316)和(0.621±0.300)，显著高于正常肾组织中的(0.377±0.149)和(0.347±0.139)(Plt;0.05)(图2)。

表1 ccRCC组织中CXCR4和MMP-2 蛋白的表达与临床病理参数的关系Table 1 Correlation of MMP-2 and CXCR4 proteinexpression with clinicopathological parameters (%, n=88)

*Plt;0.05 compared with well and moderately differentiated；#Plt;0.05 compared with stage Ⅰ and Ⅱ；△Plt;0.05 compared with positive results of lymph node metastasis.

M.marker；1，1′.expression of mRNA in normal tissue and tumor tissue of the same patient；2，2′.expression of mRNA in normal tissue and tumor tissue of the same patient图2 CXCR4和MMP-2 mRNA在肾透明细胞癌和正常肾组织中的表达Fig 2 Expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA in ccRCC and normal renal tissues

2.2.2CXCR4和MMP-2 mRNA的表达与ccRCC临床病理参数之间的关系：CXCR4和MMP-2 mRNA的表达与ccRCC的TNM临床分期、病理分级及有无淋巴结转移密切相关(Plt;0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤直径无关(表2，图3)。

表2 ccRCC组织中CXCR4和MMP-2 mRNA的表达与临床病理参数的关系Table 2 Correlation of CXCR4 and MMP-2 mRNAexpression with clinicopathological parameters

*Plt;0.05 compared with well and moderately differentiated；#Plt;0.05 compared with stage I and II；△Plt;0.05 compared with positive results of lymph node metastasis.

M.marker；0.expression of mRNA in normal renal tissues；1～4.expression of mRNA in stage Ⅰ～Ⅳ of ccRCC图3 CXCR4和MMP-2 mRNA在各分期ccRCC组织中的表达Fig 3 Expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA in different clinical stages of ccRCC

2.2.3 ccRCC组织中CXCR4和MMP-2 mRNA表达的相关性分析：在ccRCC组织中CXCR4和MMP-2 mRNA的表达呈显著正相关(Plt;0.05)。

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征之一，也是患者治疗失败和死亡的主要原因，该过程由多基因调控，复杂而有序，具有高度器官选择性。

CXCR4及其配体基质细胞衍化因子(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)所组成的生物轴在肿瘤细胞的生长、增殖、黏附及转移中发挥重要作用[5]，本研究发现CXCR4蛋白及mRNA在ccRCC组织中高表达，提示其可能参与ccRCC的发生、生长，可能与CXCR4通过促进肿瘤血管的生成从而间接促进肿瘤的生长有关。进一步研究分析显示：CXCR4在肾癌中的表达与肿瘤的临床分期、病理分级及有无淋巴结转移密切相关，提示CXCR4与肾癌的恶性程度及侵袭转移有关，其分子机制可能是高表达CXCR4的肿瘤细胞在SDF-1的趋化牵引下，逆浓度梯度转移至作为配体产生源的淋巴结，从而实现特异性转移。国外相关研究报道，高表达CXCR4的肾癌患者无病生存期短，预后差[6]，动物实验发现应用受体拮抗剂CTCE-9908可以阻断CXCR4的表达，从而抑制乳腺癌小鼠模型原发肿瘤的生长并降低肿瘤的转移率[7]。因此CXCR4有可能作为一种新的肿瘤标志物和治疗靶点，为肾癌患者病情发展及预后的评估乃至治疗提供新的思路。

细胞外基质被认为是肿瘤细胞侵袭过程中的第一道也是最主要的生理屏障，突破细胞外基质是肿瘤细胞进行侵袭和转移的必要条件。MMP-2可通过降解细胞外基质的主要成分IV型胶原及促进肿瘤血管的生成等作用参与恶性肿瘤的进展[8-9]。本研究发现MMP-2在ccRCC组织中高表达且与肾癌的临床分期、病理分级及淋巴结转移密切相关，提示MMP-2可能与ccRCC的发生、发展有关，是ccRCC具有较强侵袭、转移潜能的重要标志。

目前国内外尚无从蛋白及mRNA水平联合检测CXCR4和MMP-2在ccRCC中的表达及协同作用的相关报道。本实验证实在ccRCC组织中CXCR4和MMP-2的表达呈正相关，虽然二者在肾癌中联合表达的机制尚未明了，但我们认为这可能与二者在肾癌中有共同的信号传导通路有关，该结果提示CXCR4和MMP-2可能在ccRCC的发生、发展、侵袭及淋巴结转移中发挥协同作用。本研究为寻找ccRCC病情评估的生物学指标提供了可靠的实验依据，为ccRCC的诊治提供重要的临床价值。

[1] Rini Bl,Campbell SC,Escudier B.Renal cell carcinoma[J],Lancet,2009,373: 1119-1132.

[2] Yoshimura K,Minami T,Nozawa M,etal.Phase I clinical trial of human vascular endothelial growth factor receptor 1 peptide vaccines for patients with metastatic renal cell carcinoma[J].Br J Cancer,2013,108:1260-1266.

[3] Schrader AJ,Varga Z,Hegele A,etal.Second-line strategies for metastatic renal cell carcinoma:classics and novel approaches[J].J Cancer Res Clin Oncol,2006,132: 137-149.

[4] Andre F,Cabioglu N,Assi H,etal.Expression of chemokine receptors predicts the site of metastatic relapse in patients with axillary node positive primary breast cancer[J].Ann Oncol,2006,17:945-951.

[5] 喻松霞,李剑.CXCL12-CXCR4/CXCR7轴信号传导通路与肿瘤细胞生物学特性的关系[J].基础医学与临床,2012,32:349-353.

[6] D’Alterio C,Consales C,Polimeno M,etal.Concomitant CXCR4 and CXCR7 expression predicts poor prognosis in renal cancer[J].Curr Cancer Drug Targets,2010, 10:772-781.

[7] Huang EH,Singh B,Cristofanilli M,etal.A CXCR4 antagonist CTCE-9908 inhibits primary tumor growth and metastasis of breast cancer[J].J Surg Res,2009, 155:231-236.

[8] 王华阳,董召刚,程欢欢,等.KIF1B在瘦素促进妊娠早期绒毛滋养细胞MMP-2表达中的作用[J].基础医学与临床,2013,33:139-143.

[9] Egeblad M,Werb Z.New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression[J]. Nat Rev Cancer,2002,2:161-174.

Increased expression of CXCR4 and MMP-2 in clear cell renal cell carcinoma

LI Wen-xian1, LIN Xiao-jie2, YU Lei3, LIU Hai-lei4, CHEN Qiang1*

(1.Dept. of Urology; 2.Dept. of Pediatrics, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003;3.Dept. of Urology, Qingdao Eighth People’s Hospital, Qingdao 266100; 4.Dept. of Urology,Lu’an Group General Hospital, Changzhi 046204, China)

ObjectiveTo study the expression and significance of CXC chemokine receptor 4(CXCR4)and matrix metalloproteinases-2(MMP-2)in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC)tissues.MethodsThe expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA in 88 cases of fresh ccRCC tissues and 48 cases of normal renal tissues were detected by RT-PCR. Meanwhile, the expression of CXCR4 and MMP-2 protein was examined by immunohistochemical PV6000 assay.ResultsThe expression of CXCR4 and MMP-2 mRNA and protein in ccRCC tissues were significantly higher than those in normal ones(Plt;0.05). Furthermore, the expression of CXCR4 and MMP-2 in ccRCC tissues had a significant relationship with clinical stage, pathological grade and lymph node metastasis(Plt;0.05), while not with gender and age of patients and the diameter of tumors. Moreover, there was a positive correlation between the expression of CXCR4 and MMP-2 in ccRCC tissues (Plt;0.05).ConclusionsCXCR4 and MMP-2 may have a synergistic effect on the process of occurrence,development, invasion and metastasis of ccRCC, and thus provide a novel strategy for diagnosis and therapy of ccRCC.

clear cell renal cell carcinoma; CXCR4; MMP-2; immunohistochemistry; RT-PCR

2013-07-15

2013-10-28

山东省科技发展计划(2011YD18009)

*通信作者(correspondingauthor)： qiangqddx@163.com

1001-6325(2014)04-0499-05

研究论文

R 737.11

A