4-溴苯酚的酶催化聚合及其抗自由基性能

张 磊，张艳丽，郑 轲，高亚会，崔元臣＊

（1.河南大学 化学化工学院，河南 开封 475004；2.中原工学院 材料与化工学院，河南 郑州 451191；3.河南大学 特种功能材料重点实验室，河南 开封 475004）

酶催化反应条件较为温和，具有绿色化学的特点.其中酚类化合物在过氧化物酶为催化剂、H2O2为氧化剂的条件下可发生聚合反应，该反应提供了一种制备酚聚合物的新方法，引起了众多学者的高度关注［1-3］.由于酚类化合物在水中的溶解度较低，DORDICK首次选择有机溶剂与醋酸盐缓冲溶液组成的混合体系为介质，研究了酚化合物在辣根过氧化物酶催化下的聚合反应［4］.KOBAYASHI课题组采用类似的体系研究了苯酚［5］和双酚化合物的酶催化聚合［6］，而且发现双酚化合物的聚合产物与感光剂混合后具有很好的光致抗蚀性能.CAO发现邻氨基苯酚和对氨基苯酚的酶催化聚合反应产率较高，且产物具有一定的电活性［7］.杨刚利用酶催化聚合反应得到聚苯酚，经进一步化学修饰，制备了耐热性好的含氰基聚苯酚［8］.最近，CUI还报道了含希夫碱酚化合物的酶催化聚合［9］.可以看出，如何得到具有良好应用前景的酚聚合物逐渐成为学者们努力的方向.在此研究领域中，本课题组近年来实现了聚苯酚的酶催化可控合成，并且在聚苯酚的功能化研究方面取得了一些进展［10-12］.

4-溴苯酚是一种重要的有机化工原料，广泛用于医药、农药、阻燃剂的合成.在酚化合物的酶催化聚合研究领域，尚未发现4-溴苯酚酶催化聚合的详细报道.本文作者拟在有机溶剂-缓冲溶液的混合体系中系统研究4-溴苯酚的酶催化聚合，探讨有机溶剂种类及有机溶剂和缓冲溶液配比对聚合反应产率和聚合物相对分子质量的影响.由于利用酶催化聚合制备的酚聚合物中仍保留较多的酚羟基，我们认为这类聚合物可能具有潜在的抗氧化性能，因此本文作者进一步研究了4-溴苯酚聚合物的抗自由基性能，并且初步评价了该聚合物的抗氧化性能.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

VERTEX70型傅立叶红外光谱仪（德国，Bruker公司），溴化钾压片法；TGA/SDTA851e型热重分析仪（瑞士，Mettler-Toledo公司），升温速率为10℃/min；DSC822e差示扫描量热仪（瑞士，Mettler-Toledo公司）；凝胶渗透色谱仪（Waters 515泵，柱温为35℃，THF为流动相，流速为1.0mL/min），Wyatt DOWN Optilab rEX示差折光检测器，Wyatt DOWN HELEOSⅡ十八角度激光光散射检测器（美国，Wyatt公司）；723N型可见分光光度计（上海成光仪器有限公司）.

4-溴苯酚（纯度99%，安耐吉化学）；辣根过氧化氢酶（HRP）（RZ＝2.6，上海国源生物技术有限公司）；其余试剂均为市售分析纯试剂，使用前未提纯.

1.2 有机溶剂-缓冲溶液混合体系中4-溴苯酚的酶催化聚合

称取0.86g 4-溴苯酚（5mmol）加入到100mL圆底烧瓶中，加入一定体积比的有机溶剂和磷酸盐缓冲溶液（pH＝7），总体积为60mL，将烧瓶置于25℃恒温水浴中，开动电磁搅拌，使4-溴苯酚溶解分散均匀.称取1mg辣根过氧化物酶加入到烧瓶中，1min后在烧瓶中加入0.25mL 5%H2O2溶液，以后每隔5min加入等量的H2O2，共加入14次，待最后一次H2O2滴加完后继续反应6h，抽滤，用大量蒸馏水洗涤产物.产物在60℃真空干燥箱中干燥12h，称重并计算产率.

1.3 4-溴苯酚聚合物中羟基含量的测定

取0.1g 4-溴苯酚聚合物于干燥的100mL圆底烧瓶中，准确移取5.0mL 2.5%醋酸酐吡啶溶液加入到100mL圆底烧瓶中，开动磁力搅拌.在95℃恒温水浴中反应1h，冷却至室温，加入20mL蒸馏水，充分振荡后用0.2mol/L的NaOH溶液（准确浓度记为MNaOH）滴定，以酚酞作为指示剂，待有粉红色出现并保持0.5min内不褪色时停止滴定，记录所需NaOH溶液的体积V1（mL）.所得乙酰化产物在60℃真空干燥箱中干燥，得到土黄色固体粉末.

空白试验：准确移取5.0mL 2.5%醋酸酐吡啶溶液于100mL锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，充分振荡后用相同浓度的NaOH溶液滴定，记录所需NaOH溶液的体积V2（mL）.聚合物中羟基含量（COH）通过式（1）计算：

1.4 4-溴苯酚聚合物的抗自由基性能检测

用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）阳离子自由基检测4-溴苯酚聚合物的抗自由基性能，检测方法参照文献［13-15］.

2 结果与讨论

2.1 4-溴苯酚的酶催化聚合

首先研究了有机溶剂类型对4-溴苯酚酶催化聚合反应产率的影响，所选择的六种有机溶剂分别为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、DMF和1，4-二氧六环，每个反应体系中有机溶剂和缓冲溶液的体积比固定为1∶1，反应结果见表1.可以看出，在所选择的有机溶剂和缓冲溶液体系中，4-溴苯酚均可发生酶催化聚合反应，产率中等.另外可以看到，在所选择的实验条件下，有机溶剂种类对聚合物产率并没有明显的影响.

表1 4-溴苯酚在不同有机溶剂和缓冲溶液中的酶催化聚合Table 1 Enzymatic polymerization of 4-bromophenol in the mixture of buffer and various organic solvent

以价格低、毒性小的乙醇为有机溶剂，研究了乙醇与磷酸盐缓冲溶液（pH＝7）配比对4-溴苯酚聚合反应的影响，结果见表2.可以明显看出，乙醇与缓冲溶液的配比对聚合物产率有很大的影响，反应体系中乙醇的用量为15～30mL时4-溴苯酚聚合反应的产率较高（表2，Entries 2-5），增加或降低乙醇的用量反应产率均出现明显降低.TONAMI曾在甲醇和缓冲溶液混合体系中研究了间甲酚的酶催化聚合，发现甲醇和缓冲溶液体积比为1∶1时可得到接近100%的产率［16］.而对叔丁基苯酚在异丙醇和缓冲溶液混合体系中进行的酶催化聚合，当异丙醇的含量为30%时聚合反应的产率最高［17］.结合这些研究报道，我们认为在有机溶剂与缓冲溶液混合体系中，酚化合物种类以及有机溶剂与缓冲溶液的配比共同影响了聚合反应的产率.

表2 乙醇和缓冲溶液配比对4-溴苯酚酶催化聚合反应的影响Table 2 Effect of the volume ratio of ethanol to buffer on enzymatic polymerization of 4-bromophenol

2.2 4-溴苯酚聚合物的分子量检测

凝胶渗透色谱和静态光散射联用可对聚合物的绝对重均相对分子质量进行测定［18］，我们采用这种方法检测了4-溴苯酚聚合物的平均相对分子质量.首先对4-溴苯酚聚合物四氢呋喃溶液的折光指数增量（dn/dc）进行了测定.当浓 度 分 别 为0.97、2.09、2.87、3.98、5.17g/L时，4-溴苯酚聚合物四氢呋喃溶液的折光指数如图1所示，根据折光指数和聚合物浓度的线性关系，可以得到4-溴苯酚聚合物四氢呋喃溶液的dn/dc值为0.166 9，由此得到的4-溴苯酚聚合物的重均相对分子质量列于表1和表2中.从表1可以看出，在有机溶剂和缓冲溶液等体积配比的体系中，采用甲醇和乙醇作为有机溶剂时，所得聚合物的相对分子质量较低，而甲醇体系中所得聚合物的相对分子质量最小（表1，Entry 1）.这可能是由于甲醇和缓冲溶液混合体系对聚合过程中生成的酚低聚物的溶解性差，使其过早沉淀析出，无法形成高相对分子质量聚合物造成的.采用丙酮、乙腈、1，4-二氧六环、DMF为有机溶剂时所得聚合物的相对分子质量均在6.5×104以上.表2列出了乙醇和缓冲溶液不同配比条件下所得4-溴苯酚聚合物的平均相对分子质量.总体上看，随乙醇含量的增加，聚合产物的相对分子质量呈上升趋势.而在对聚合反应产率的研究中，我们发现乙醇与缓冲溶液体积比为15∶45时，4-溴苯酚（表2，Entry 2）聚合物的产率较高.这些研究结果表明影响聚合产物相对分子质量和产率的因素是不同的.我们认为，酚化合物在反应介质中的分散性及酶活性对反应产率影响较大，而反应介质对酚低聚物的溶解性好坏决定了聚合产物相对分子质量的高低.

图1 示差折光指数与4-溴苯酚聚合物溶液浓度之间的线性关系Fig.1 Linearity of refractive index（RI）versus concentration of 4-bromophenol polymer solution

2.3 4-溴苯酚聚合物的结构和性能研究

图2中曲线a为4-溴苯酚聚合物的红外光谱图，3 413cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，1 579和1 481 cm-1处是苯环骨架振动吸收峰，3 068cm-1处为苯环C-H伸缩振动吸收峰，1 209cm-1处是C-O-C（或COH）的振动吸收峰，1 112cm-1为醚键伸缩振动吸收峰.因此，4-溴苯酚聚合物链中仍含有羟基，存在苯-苯和苯-氧两种连接方式.为了进一步测定聚合产物中羟基的含量，我们对其进行了乙酰化处理.图2中曲线b为4-溴苯酚聚合物乙酰化产物的红外光谱图，3 413cm-1处的O-H伸缩振动吸收峰消失，同时在1 767cm-1处出现C＝O的伸缩振动吸收峰，说明聚合物的乙酰化反应比较彻底.经滴定分析，各条件下制备的聚合物中羟基的含量在2.0～2.9mmol/g（表1和表2）.

图3为4-溴苯酚聚合物的热重曲线，在空气和氮气氛围中，4-溴苯酚聚合物分解5%时对应的温度分别为274和242℃，在空气氛围中聚合物完全分解时对应的温度为600℃，在氮气氛围中，聚合物在1 000℃时的质量残余率为31.5%，表明该聚合物具有较好的热稳定性.

图2 4-溴苯酚聚合物（a）及其乙酰化产物（b）的红外光谱图Fig.2 FT-IR spectra of 4-bromophenol polymer（a）and acetylated 4-bromophenol polymer（b）

图3 4-溴苯酚聚合物在氮气（a）和空气（b）中的热重曲线Fig.3 TG curves of 4-bromophenol polymer under nitrogen（a）and under air（b）

2.4 4-溴苯酚聚合物抗自由基性能研究

众所周知，酚化合物是一类重要的抗氧剂，在塑料、橡胶、润滑品、食品中均有广泛的应用.由于高相对分子质量酚化合物具有挥发性低、耐抽提、耐高温等优点，因而近年来逐渐成为抗氧剂研究领域中一个重要的发展方向.4-溴苯酚聚合物中仍含有大量羟基，这可能赋予聚合物良好的抗氧化性能.对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除率常被用来评价物质的抗氧化能力［13-15］，我们利用这两种方法初步评价了4-溴苯酚聚合物的抗氧化性能，测定样品为等体积乙醇和缓冲溶液体系中得到的聚合产物.选定DPPH自由基乙醇溶液的浓度为50mg/L，考察了不同浓度的4-溴苯酚聚合物对DPPH自由基的清除率，结果见图4.可以看出，该聚合物具有明显的清除DPPH自由基的能力，其浓度为100mg/L时，对DPPH自由基的清除率为30.5%，随4-溴苯酚聚合物浓度的增加，对DPPH自由基的清除率逐渐增大.随后，我们进一步考察了不同浓度的4-溴苯酚聚合物对ABTS阳离子自由基的清除率，结果见图5，当4-溴苯酚聚合物的浓度为30mg/L时，对ABTS阳离子自由基的清除率达到50%以上，显示出良好的抗氧化性能.

图4 4-溴苯酚聚合物对DPPH自由基的抑制率Fig.4 Inhibition efficiency of 4-bromophenol polymer to DPPH free radical

图5 4-溴苯酚聚合物对ABTS阳离子自由基的抑制率Fig.5 Inhibition efficiency of 4-bromophenol polymer to ABTS cation free radical

3 结论

在辣根过氧化物酶为催化剂、H2O2为氧化剂的条件下，4-溴苯酚在有机溶剂和缓冲溶液的混合体系中可发生氧化聚合反应.有机溶剂和缓冲溶液的配比对聚合物产率有很大影响.而有机溶剂的类型及有机溶剂和缓冲溶液的配比均对聚合产物的相对分子质量有明显的影响.4-溴苯酚聚合物中含有苯-苯连接和苯-氧连接两种结构，具有较好的热稳定性.利用酶催化聚合反应可以方便地得到4-溴苯酚聚合物，由于分子结构中仍存在大量的酚羟基，该聚合物具有明显的抗自由基能力，预示其具有良好的抗氧化性能.因此，本研究为新型抗氧剂的结构设计和合成提供了一种新的思路，同时也拓宽了酚类化合物酶催化聚合反应的应用领域.

［1］KOBAYASHI S，MAKINO A.Enzymatic polymer synthesis：an opportunity for green polymer chemistry［J］.Chem Rev，2009，109：5288-5353.

［2］GHOUL M，CHEBIL L.Enzymatic polymerization of phenolic compounds by oxidoreductases［M］.Publisher：Springer，2012.

［3］REIHMANN M，RITTER H.Synthesis of phenol polymers using peroxidases［J］.AdvPolym Sci，2006，194：1-49.

［4］DORDICK J S，MARLETTA M A，KLIBANOV A M.Polymerization of phenols catalyzed by peroxidase in nonaqueous media［J］.Biotechnol Bioeng，1987，30：31-36.

［5］OGUCHI T，TAWAKI S，UYAMA H，et al.Soluble polyphenol［J］.Macromol Rapid Commun，1999，20：401-403.

［6］KADOTA J，FUKUOKA T，UYAMA H，et al.New positive-type photoresists based on enzymatically synthesized polyphenols［J］.Macromol Rapid Commun，2004，25：441-444.

［7］SHAN J Y，HAN L Y，BAI F L，et al.Enzymatic polymerization of aniline and phenol derivatives catalyzed by horseradish peroxidase in dioxane（Ⅱ）［J］.Polym Adv Technol，2003，14：330-336.

［8］王宜鹏，洪海兵，曾 科，等.酶催化聚酚及其衍生物的合成和热性能［J］.高分子材料科学与工程，2009，25（8）：5-7.

［9］CUI Y S，HAN X Q，DING Y J，et al.Enzymatic synthesis of polyphenols with longer conjugation lengths［J］.Polym Bull，2010，64：647-656.

［10］ZHANG L，ZHAO W S，CHEN H Z，et al.Enzymatic synthesis of phenol polymer and its functionalization［J］.J Mol Catal B：Enzym，2013，87：30-36.

［11］ZHANG L，ZHAO W S，MA Z L，et al.Enzymatic polymerization of phenol catalyzed by horseradish peroxidase in aqueous micelle system［J］.Eur Polym J，2012，4：580-585.

［12］ZHANG L，ZHANG Y D，XUE Y Y，et al.Enzymatic synthesis of soluble phenol polymer in water using anionic surfactant as additive［J］.Polym Int，2013，62：1277-1282.

［13］李 洋，钦传光，尚晓娅，等.甜樱桃色素的提取及抗氧化活性［J］.化学研究，2008，19（4）：28-31.

［14］DUDONNÉS，VITRAC X，COUTIÉRE，et al.Comparative study of antioxidant properties and total phenolic content of 30plant extracts of industrial interest using DPPH，ABTS，FRAP，SOD，and ORAC assays［J］.J Agric Food Chem，2009，57：1768-1774.

［15］KANG W Y，WANG J M.In vitro antioxidant properties and in vivo lowering blood lipid of forsythia suspense leaves［J］.Med Chem Res，2010（19）：617-628.

［16］TONAMI H，UYAMA H，KOBAYASHI S，et al.Peroxidase-catalyzed oxidative polymerization of m-substituted phenol derivatives［J］.Macromol Chem Phys，1999，200：2365-2371.

［17］MITA N，MARUICHI N，TONAMI H，et al.Enzymatic oxidative polymerization of p-t-butylphenol and characterization of the product polymer［J］.Bull Chem Soc Jpn，2003，76：375-379.

［18］刘承果，谢鸿峰，郑 云，等.示差折光和光散射双检测体积排除色谱的绝对定量化［J］.高分子学报，2008，11：1031-1036.