心康冲剂对慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA表达的影响

谭 雄，张 辉，聂孝平，王建国，毛湘屏，陈朝晖，毛以林*

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

慢性心力衰竭 （Chronic heart failure，CHF）是各种心血管疾病的终末阶段，病死率高，水潴留是其最重要的病理生理变化之一[1]。 研究表明CHF 时水潴留机制的主要途径：心输出量下降，由下丘脑产生的血管加压素（arginine vasopressin，AVP）水平升高，作用于肾脏集合管主细胞AVPV2 受体，通过异三聚体G 蛋白(Gs 蛋白)激活膜内腺苷酸环化酶，使主细胞内cAMP 升高， 继而激活胞质内蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，使AQP2 发生磷酸化并由胞浆囊泡向管腔膜转移，通过胞吐作用融合并嵌入管腔膜，水通道开放，形成水潴留[2]。 前期临床研究表明，临床效方心康饮对慢性心衰合并利尿剂抵抗的患者具有良好效果［3］，现将该方制作成颗粒冲剂，观察其对慢性心衰大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA的影响，进一步探讨其抗心衰作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级雄性SD 大鼠70 只， 体质量180～220 g， 由湖南斯莱克景达实验有限公司提供动物许可证号：SCXK（湘）2011-0003。

1.1.2 药物 盐酸多柔比星，深圳万乐药业(批号：1206E5)； 芪苈强心胶囊， 石家庄以岭药业 （批号：123901）； 心康冲剂（黄芪30 g， 白参10 g， 陈皮10 g，茯苓15 g，桂枝6 g，制附片10 g，薏苡仁30 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g，柴胡5 g，升麻5 g，桔梗5 g，砂仁6 g），经湖南省中医院药剂科制成颗粒剂（15 g/包），每克相当于生药3.38 g。

1.1.3 试剂 常规化学试剂由北京化学试剂公司提 供；Tris、Trizol、DEPC 均 由Sigma 提 供；SYBGREEN PCR Mix Mix、Taq 酶、 逆 转 录 试 剂 盒、DL1000 DNA Marker、dNTP 均 购 于Genstar；EDTA由Fermentas 提供；E.B.购买于ABI；水合氯醛由天津科密欧化学试剂公司提供。

1.1.4 仪器 旋涡混合器VORTEX-5、 摇床ZD-2008（江苏海门其林贝尔仪器公司）；台式冷冻离心机5417R (德国eppendorf 公司)； 荧光定量RCP 仪Thermo Scientific/ARL（美国Thermo 公司）；水平琼脂糖电泳仪DYCP-34A（北京六一仪器厂）；电动玻璃匀浆器DY89-Ⅱ （宁波新芝科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 利用EXCEL 表格随机数生成法抽取10 只大鼠为正常对照组， 其余大鼠造模成功后，分为模型对照组，心康冲剂低、中、高剂量组，芪苈强心组（对照组），每组各12 只。

1.2.2 造模方法 参考相关文献[4-6]，除正常组外，其余各组使用盐酸多柔比星腹腔注射法建立心衰动物模型2 mg/kg，每周1 次，共10 周，总剂量为20 mg/kg。预实验建模结束后，处死大鼠速取心脏，投入10%甲醛溶液固定24 h， 石蜡包埋切片，HE染色。

1.2.3 给药方法 大鼠给药剂量按等效体表面积折算[8]，心康冲剂等效（低）剂量组、2 倍等效（中）剂量组、4 倍等效（高）剂量组，给药剂量分别为1.08、2.16、4.32 g/kg；对照组灌服芪苈强心胶囊，按等效剂量给药浓度为0.06 g/kg；空白、模型对照组均灌服等体积蒸馏水。 以上各组均每天灌胃1 次，2 mL/次。

1.2.4 Real-time PCR 法检测AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的表达 第6 周实验结束后， 各组随机取存活大鼠6 只， 取下丘脑及肾脏，Trizol 法提取总RNA，以总RNA 为模板，逆转录得到cDNA。 操作步骤均按试剂盒说明书进行， 紫外分光光度计检测RNA纯度。 引物由上海生工提供。 以β-actin 为内参基因，引物序列参考相关文献[9-10]，使用Primer primer5软件设计完成，β-actin-F：5’- CATCCTGCGTCTGGACCTGG -3’，β -actin -R：5’ -TAATGTCACGCA GATTTCC-3’ 扩增片段长度107 bp，AQP2-F：5’-GGGACCTGGCGTCAATGCTC -3’AQP2 -R：5’ -GCTCGTCGGTGGAGGCAAAGAT-3’扩增片段长度114 bp，AVPV2-F：5’-CTGGCACCAGACTGGCGTGTAT-3’，AVPV2 -R：5’ -TGCTCAGCGTGATGTGGGAAAT-3’扩增片段长度182 bp，由上海生工合成提供。 PCR 反应体系为30 μL，包括上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，PCR H2O 13 μL，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL， 扩增条件：预变性95 ℃10 min；变性95 ℃10 min；退火/延伸59 ℃50 s，共40 次循环。 采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA 转录水平的相对表达。 Ct 为目的基因扩增到预定荧光信号强度所需要的循环数，ΔCt为目的基因Ct 与同一样品action 的Ct 的差值，ΔΔCt 为目的样品与空白组样品ΔCt 之间的差，每一组都以空白组样品为1，相对表达量=2-ΔΔCt，每一个样品重复3个孔。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 光学显微镜下观察心肌病理改变

与文献报道[7]大致符合CHF，证明造模成功。 结果如图1、2 所示，见封三彩图。

2.1 RT-PCR 溶解曲线分析

结果显示，各实验组AQP2 和AVPV2 溶解曲线中均有单一的主峰，溶解温度为84 ℃，相同扩增条件下重复多次，得到的AQP2 和AVPV2 溶解温度均在 （84±1）℃， 说明扩增的为特异性产物。见图3-4。

图3 肾脏集合管主细胞AQP2 溶解曲线（n=3）

图4 肾脏集合管主细胞AVPV2 溶解曲线（n=3）

2.2 AQP2 和AVPV2mRNA 表达的2-ΔΔCt 值

结果显示， 心康冲剂可显著抑制AQP2mRNA、AVPV2mRNA 在心力衰竭大鼠肾脏集合管主细胞的过度表达，从而减少水潴留。 见图5-6。

图5 肾脏集合管主细胞AQP2 扩增曲线（n=3）

图6 肾脏集合管主细胞AVPV2 扩增曲线（n=3）

2.3 各组大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比较

与正常对照组相比， 模型组的AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表达均显著升高（均P＜0.05）；与模型组相比芪苈强心组、 心康冲剂各组AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表达下降，差异有统计学意义（均P＜0.05）。 与 芪 苈 强 心 组 相 比， 心 康 冲 剂 各 组AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表达下调更为明显 （均P＜0.05）；心康冲剂各组间AQP2mRNA、AVPV2mRNA 表达无明显差异（P>0.05）。 见表1。

表1 各组大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比较（±s，n=6）

表1 各组大鼠AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的比较（±s，n=6）

注：与对照组比较●P＜0.05；与模型组比较○P＜0.05；与芪苈强心组比较△P＜0.05。

组 别正常对照组模型对照组芪苈强心组心康低剂组心康中剂组心康高剂组药物浓度(g/mL)— —0.06 1.08 2.16 4.32 AQP2mRNA 1.067±0.064 4.622±0.125●3.585±0.080●○2.313±0.090●○△2.359±0.066●○△2.393±0.079●○△AVPV2mRNA 1.202±0.084 5.444±0.414●3.789±0.362●○2.367±0.273●○△2.482±0.259●○△2.691±0.260●○△

3 讨论

慢性心力衰竭（CHF）是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈和射血功能受损的一组复杂临床综合征，有典型的症状（即呼吸困难、疲乏）和液体潴留（肺淤血或外周水肿）[11]。利尿剂是唯一能充分控制和有效消除液体潴留的药物， 但并不能维持长期的稳定临床疗效。 慢性心衰属于中医学 “胸痹”、“厥心痛”、“水肿”等范畴。 毛以林主任医师通过长期临床观察发现其病机关键是宗气下陷、脾肾阳虚、水湿内停，并制定出以升补宗气、温阳利水为基本治法的临床效方心康冲剂。 方中大剂黄芪升补下陷之宗气，白参补心肺之气共为君药，前者补中带升，后者补气雄厚；柴胡、升麻提升清阳之气；桔梗为舟揖之药，载诸药上达而使药至病所；茯苓、薏苡仁甘淡健脾利水；生姜皮、大腹皮专利肌肤之水；砂仁化湿运脾，陈皮理气，因气能行水化水；制附片温补肾阳，桂枝温阳化气，诸药和而为功。

在慢性心衰水潴留机制中，肾脏是水潴留的关键环节。 AQP2 主要位于肾脏集合管主细胞管腔侧的囊泡内，是肾脏重吸收水分，浓缩尿液，调节机体水钠平衡的关键蛋白，在慢性心衰水潴留中发挥重要作用[12]，主要体现在AQP2 通过调节插入集合管上皮细胞顶端膜上的数量来调节集合管对水的通透性，调控主要有短期调控与长期调控两种方式[13]：一是AVP 与肾集合管主细胞V2 受体结合激活蛋白激酶A，使胞浆囊泡中的AQP2 发生磷酸化，触发AQP2 向管腔膜转移，融合嵌入管腔膜，致管腔膜上的AQP2 密度增加，水通道开放，水的通透性增加，此即短期调控的“穿梭机制”；二是AVP 水平持续升高可长期刺激主细胞促使AQP2 基因活化， 在转录水平使AQP2 增加，集合管AQP2 绝对数量增加，从而增加水的转运能力[14-15]。 从而导致水钠潴留，心脏容量负荷增加，加重心功能衰竭。

本研究发现心康冲剂能够下调心衰大鼠肾脏AQP2mRNA、AVPV2mRNA 的表达， 这可能系该方临床具有良好利尿效果，从而减少水潴留，改善心功能作用机制之一，值得进一步探索研究。

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