头穴丛刺结合丰富环境刺激对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞增殖迁移的影响

刘波，邹伟，唐强，颜培宇

缺氧缺血性脑损伤(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)是指在围产期窒息缺氧等因素导致的脑部缺氧缺血性损害，而此类疾病的治疗至今仍为世界性医学难题。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有高度增殖和自我更新以维持自身数目恒定的能力[1]。目前大量实验研究表明，脑缺氧缺血后，神经再生和脑组织功能恢复的机制是由于内源性NSCs的大量增殖、迁移和分化[2-4]。本研究通过观察头穴丛刺结合丰富环境刺激干预对HIBD新生大鼠内源性NSCs增殖迁移的影响，探讨其改善HIBD神经功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

7日龄Wistar大鼠120只，由上海斯莱克公司提供，雌雄不限，体质量11～15 g。按随机数字表法分为假手术组(A组)、造模组(B组)、头穴丛刺组(C组)、丰富环境刺激组(D组)和头穴丛刺结合丰富环境刺激组(E组)。每组24只，均选取3 d、7 d、14 d 3个时间点，每个时间点8只。

1.2 模型制作

按照Rice法建立HIBD动物模型。7日龄新生Wistar大鼠，吸入适量无水乙醚麻醉，暴露颈部[5]。局部碘伏消毒，做颈部正中切口，无菌分离左侧颈总动脉，并用外科0号灭菌手术丝线行双线结扎左侧颈总动脉，缝合伤口。手术结束后，将动物放回原饲养环境中恢复120 min，置于自制有机玻璃缺氧箱中，保持37℃水浴恒温，持续将体积浓度为8%氧气和92%氮气的混合气体以0.5 L/min输入缺氧箱中。术后出现平衡异常、不能翻身或夹尾左旋者视为造模成功，将其纳入实验。A组仅分离左侧颈总动脉，不结扎，也不予以缺氧处理。

1.3 干预方法

A组术后置于普通母鼠笼中饲养，不予任何治疗。

B组术后另置普通母鼠笼中饲养，不予任何治疗。

C组采用丛刺法，按照“大鼠穴位图谱”[6]所示，取百会穴及百会左、右侧各旁开1 mm处针刺。每穴快速捻转1 min后留针120 min，每天1次。

D组每天将幼鼠分离放入丰富环境(enriched environment,EE)笼[7]内，EE笼为70×60×50 cm的大笼，笼内放置各种质感的砂纸、毛刷，有刺激性气味的薄荷、柠檬和冰冷的金属，以及斜坡、转盘、管道、秋千、跷跷板、小球等“玩具”。给予丰富环境干预120 min。同时配合播放舒缓的轻音，明暗红色灯光照射。

E组予以头穴丛刺后，将幼鼠放入EE笼中给予环境刺激120 min，拔针放回母鼠笼中。

1.4 内源性NSCs的标记[8]

将5-溴脱氧尿核苷(BrdU，美国SIGMA公司)用生理盐水配制成5 mg/ml的溶液。各组分别于造模后24 h腹腔注射BrdU 50 mg/kg，每天1次，持续7 d。

1.5 免疫组化

将大鼠用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔麻醉，4%多聚甲醛心脏灌注取脑。常规方法制成石蜡块，应用恒冷切片机(德国LEICA)切片，片厚4μm。0.01 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗3次，每次5 min；切片入10 g/L H2O2，室温30 min；加入2 mol/L HCl，37℃ 45 min；切片入0.1 mol/L硼酸(pH 8.5)10 min；100 g/L正常羊血清封闭，37℃30 min；加入一抗神经巢蛋白(nestin)(1∶200，北京博奥森生物技术有限公司)、BrdU(1∶200，福州迈新生物技术开发有限公司)，4℃冰箱过夜；滴加过氧化物酶标记的抗鼠/兔IgG(MaxVionTM，福州迈新生物技术开发有限公司)，避光条件下37℃孵育60 min；DAB显色后，进行脱水、透明、封片。选择侧脑室下带及额叶皮层处各3张切片，每张切片光镜下选取4个高倍视野，计阳性细胞数。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行分析。组间差异进行单因素方差分析，组间两两比较用LSD法。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BrdU阳性细胞数

BrdU阳性细胞呈棕黄色，分布于侧脑室下区(SVZ)和大脑皮层等部位。B组BrdU阳性细胞数与A组同期比较明显增加(P＜0.01)。C、D、E组BrdU阳性细胞数与B组同期比较明显增加(P＜0.01)；E组BrdU阳性细胞数与C、D组同期比较增加(P＜0.05)。见表1。

2.2 nestin阳性细胞数

B组SVZ和大脑皮层nestin阳性细胞数与A组同期比较明显增加(P＜0.01)；C、D、E组nestin阳性细胞数与B组同期比较明显增加(P＜0.01)。各时间点C组、D组nestin阳性阳性细胞数相比无显著性差异(P＞0.05)；E组nestin阳性细胞数与同期C组、D组比较明显增加(P＜0.01)。见表2。

表1 各组Brd U阳性细胞数(/mm2)

表2 各组nestin阳性细胞数(/mm2)

3 讨论

NSCs广泛存在于哺乳动物中，产生NSCs的部位主要位于SVZ和海马齿状回的颗粒下区(SGZ)[9]。通常成年脑内的NSCs处于静息状态，在某些因素的刺激下，NSCs会被激活并增殖，在其他趋化因子的作用下向损伤部位迁移、分化[10-11]。Zhang等在实验研究中发现，脑卒中后第2天大鼠SVZ NSCs开始增殖，第7天达到高峰，第14天时分裂细胞比例恢复至第2天水平[12]。

头穴丛刺是于致顺教授在大量的临床经验和科研工作的基础上对头穴针刺系列研究的总结与深化。其头穴丛刺长留针可以减少日针刺数，并达到足够有效的刺激量，克服重复针刺给患者带来的痛苦；同时头穴丛刺法便于与康复方法结合，以康复技术代替体针治疗，以动态治疗方法代替静态治疗方法，可以起到相辅相成的作用。

新生儿出生后，神经系统仍然没有发育成熟，神经细胞和突触数量持续增加，直至2岁左右达到一个稳定的水平。在此期间，中枢神经系统可塑性极强，不断发生神经再生、分化、凋亡以及神经元轴突的生长、剪切、髓鞘形成等过程。这可能是早期康复干预可行性的生物学基础。近年来利用环境康复疗法治疗发育期脑损伤日益得到人们的重视。临床研究也证实，发育早期丰富环境干预有利于脑发育和脑功能的发挥，丰富环境刺激可增强中枢神经系统的突触可塑性，促进脑发育和脑损伤的修复[13]。环境康复疗法有望成为临床治疗HIBD及减轻脑损伤后遗症的经济、无创、无痛苦的有效方法。

大量的实验研究表明，针刺和丰富环境刺激对内源性NSCs的增殖分化后的神经功能恢复都有重要作用。唐强等电针取穴曲池和足三里，观察针刺对脑缺血再灌注大鼠内源性NSCs增殖及迁移的影响，发现电针法能够促进与增殖和迁移有关的细胞因子表达，改善NSCs增殖、迁移的微环境，促进NSCs分化[14]。Komitova等实验发现，与未接受丰富环境刺激组比较，丰富环境可以促进脑缺血大鼠SVZ NSCs的增殖[15]。而我们在前期的实验中证实，脑缺氧缺血后，头穴丛刺结合环境刺激可促进海马微管相关蛋白-2和突触素的阳性表达[5]。早期给予头穴丛刺和丰富环境刺激干预，可以明显改善HIBD新生大鼠学习记忆能力，甚至可能使学习记忆功能恢复到正常水平[16-17]。

本实验显示，头穴丛刺结合丰富环境刺激可促进HIBD新生大鼠内源性NSCs的增殖、迁移，明显优于单纯头穴丛刺或丰富环境刺激，这可能是头穴丛刺结合环境刺激促进脑缺氧缺血后神经功能恢复的机制之一。

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[5]刘波,唐强,邢艳丽,等.头穴丛刺结合环境刺激对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马微管相关蛋白-2和p38表达影响的实验研究[J].针灸临床杂志,2011,27(2):63-66.

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