两起新型布尼亚病毒感染病例的病毒序列分析

石利民+何敏+乔梦凯+雍玮+曾理+王璇+张洪英+丁洁

【摘要】 目的：分析发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒感染（SFTSV）感染患者的临床特点、流行病学以及SFTSV基因序列。方法：收集本市2014年4-6月某医院送检的2例重症发热伴血小板减少（SFTS）患者的血清标本，经核酸荧光PCR检测阳性确诊。对病毒核酸测序并与GenBank数据比对。结果：两名患者均有典型的SFTSV感染的临床症状，以发热、腹泻为首发症状，血常规见粒系及血小板呈进行性降低。从2例患者血清提取的核酸经测序，其基因序列与GenBank中的SFTSV进行比对，0428株（安庆）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性与安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均达到99%。0507株（滁州）上述目的基因与江苏株JS2011-013-1的同源性高达99%。结论：SFTSV在本地区散发存在，基因序列分析结果提示其来源或有差异。

【关键词】 布尼亚病毒感染； 发热； 血小板减少； 基因； 病毒； 序列分析

Viral Sequence Analysis of Two Cases with SFTSV Infections/SHI Li-min， HE Min， QIAO Meng-kai， et al.//Medical Innovation of China，2014，11（31）：018-020

【Abstract】 Objective： To investigate the clinical characteristics and epidemiology of patients infected with severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus （SFTSV） and the genetic background of the SFTSV. Method： Clinical and epidemiological data of two cases with severe fever with thrombocytopenia syndrome （SFTS）， collected from a hospital in Nanjing during April 2014 to June 2014， were retrospectively analyzed. Nucleic acid was extracted from the serum of the two SFTSV cases. After specific polymerase chain reaction（PCR）， the nucleic acid sequences were compared with those in GenBank using the BLAST facility. Result： Two patients presented typical clinical symptoms of SFTSV infection， with acute onset of fever and diarrhea. Routine blood examination showed that neutrophils and platelets progressively decreased. The results of alignment with database in GenBank， showed that RNA-dependent RNA polymerase gene， the glycoprotein gene and NS protein gene of the sample 0428（Anqing） had 99% homology with AHL/China/2011， the representative strain of AnHui Province. While the genes of sample 0507（Chuzhou） had 99% homology with JS2011-013-1， the representative strain of JiangSu Province. Conclusion： The results suggest that SFTSV occur sporadically in Nanjing and its origin might be diverse.

【Key words】 SFTS bunyavirus； Fever； Thrombocytopenia syndrome； Gene； Viral； Sequence analysis

First-authors address： Nanjing Municipal Center for Disease Control and Prevention， Nanjing 210003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.31.006

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（Severe Fever With Thrombocytopenia Syndrome Bunyavirus， SFTSV）是我国2010年新发现的布尼亚病毒科白蛉病毒属的新病毒。SFTSV感染主要导致发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome， SFTS），引起以发热伴血小板、白细胞减少、严重的胃肠道症状、浅表淋巴结肿大为主要特征的临床症状，是一种新发传染病，患者可因多脏器功能衰竭而死亡，病死率较高。河南、湖北、山东、安徽、辽宁、江苏等省均已出现该病病例[1-2]。新型布尼亚病毒可能为一种由蜱传播的自然疫源性疾病[3-6]，螨类、鼠类与人群发病之间应有一定的联系[7]，但其在自然界中的循环传播模式尚不完全清楚。江苏省丘陵地区总面积占全省总面积的15%，造成江苏SFTSV流行的主要原因可能是因为其地貌特点[8]。2014年4-5月，两名安徽患者就诊于南京某医院，笔者对其开展了流行病学调查和实验室病原学检测，采用实时荧光定量RT-PCR及产物测序对布尼亚病毒核酸进行鉴定和分子进化分析。

1 资料与方法

1.1 流行病学资料 2014年4-5月，南京某医院收治两名SFTS患者，均为男性，年龄分别为62岁和77岁，来自安徽两个城市的不同乡村，职业均为农民，居住地为丘陵或山区，均无疫区居留史，均无布尼亚病毒阳性患者接触史。蜱虫叮咬史均不详。其中一名患者发病前两周有采茶经历，另一名患者发病前两周有种地、割草史。

1.2 临床特征 2名患者均以发热、腹泻为首发症状。其中一名患者皮肤见瘀点和瘀斑。

1.3 实验室检查 血常规见粒系及血小板呈进行性降低，其中WBC下降至（0.88～1.47）×109/L，PLT最低为40×109/L，血液生物化学检测酶谱较高，包括转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等均明显升高，肾功能损害，肌酐升高，低钙血症。

1.4 病原学检查 从患者血清提取病毒核酸，使用台塑公司组织RNA全自动萃取试剂盒提取RNA，按试剂盒说明书操作。实时荧光定量PCR检测：S-F： GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA，S-R： TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT，探针：FAM-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC（引物序列由江苏省疾控中心提供）。PCR反应体系用QIAGEN公司的QuantiTect? Probe RT-PCR Kit（Cat.No 20443）试剂盒配制。扩增反应条件：反转录50 ℃ 30 min；变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃40 s；扩增40个循环。标准模式为每个循环60 ℃ 40 s时收集荧光。Ct值≤37且有对数增长曲线的为扩增阳性，Ct值>37且有对数增长曲线需重复实验，仍有数增长曲线的为扩增阳性，无对数增长曲线的为扩增阴性。反应在ABI 7500 fast 荧光定量PCR 仪上进行。分析软件为SDS v1.3.2。

1.5 序列测定 用参考文献[9-10]所述方法对布尼亚病毒基因组依赖RNA的RNA聚合酶、糖蛋白、N蛋白以及核衣壳蛋白区域进行RT-PCR扩增，引物具体序列如下：bun rdrp-S：5'-ATGGACAACCCTGCATTCG-3，bun rdrp-AS： TCAGCTTCTAGGCTAAAACCAG；bun gly 601-S：AAGAGTTTTAGCCAAAGTGAATTCCC，bun gly 1753-AS：ACATTCCTTCATATTTCCGCTCCC；bun NS 1043-S：CTTCAGCCACTTCACCCGAAC，bun NS 1646-AS：GCAGCAGCTCAATTTGACT。由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。反应采用Takara公司的Primer-Script one step RT-PCR kit Ver.2进行反应，反应步骤如下：取标本2 μL，体系为20 μL， 其中2×1 Step Buffer 10 μL， Taq 酶0.8 μL，步骤为50 ℃ 30 min，94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s， 72 ℃ 7 min延长，35 cycles。PCR 产物用QIAXCEL毛细管电泳仪观察结果。

1.6 序列测定和分析 将PCR阳性产物送金斯瑞（南京）科技有限公司纯化和测序。从GenBank的核酸序列数据库中下载SFTSV的核酸序列片段，将下载序列同本研究检测到的序列利用GenBank进行序列比对和同源性分析。

2 结果

2.1 对比结果 0428株和0507株均获得1000 bp的依赖RNA的RNA聚合酶条带、1156 bp的糖蛋白条带和537 bp的N蛋白条带，见图1。

2.2 在GenBank上进行序列比对和同源性分析的结果 布尼亚病毒（0428）的序列比对结果：依赖RNA的RNA聚合酶基因、糖蛋白基因、非结构蛋白基因与GenBank中安徽株AHL/China/2011的L大片段（Accesion JQ670934.1）、M片段（JQ670930.1）、S片段（JQ670932.1）同源性分别达99%、99%、99%，与河南株HNXY_212的L大片段（KC292327.1）、M片段（KC292300.1）、S片段（KC292273.1）同源性分别达96%、96%、98%，与江苏株JS2011-109的L大片段（KC505138.1）、M片段（KC505139.1），S片段（KC505140.1）同源性分别达95%、97%、98%。

另一株布尼亚病毒（0507）的序列比对结果：依赖RNA的RNA聚合酶基因、糖蛋白基因、非结构蛋白基因与江苏株JS2011-013-1的L大片段（Accesion KC505126.1）、M片段（Accesion KC505127.1）、S 片段（KC505128.1）同源性分别达99%、99%、99%，与河南株HNXY_212的L大片段（KC292327.1）、M片段（KC292300.1）、S片段（KC292273.1）同源性分别达96%、95%、95%，与安徽株AHL/China/2011的L大片段（Accesion JQ670934.1）、M片段（JQ670930.1）、S片段（JQ670932.1）同源性分别达95%、95%、96%。

3 讨论

SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，病毒颗粒为具包膜的球形，直径80～100 nm，主要分布在细胞内微粒体，表面有糖蛋白突起等。基因组含3个单股负链RNA片段，分别为L、M和S片段，L片段全长为6368个核苷酸，包含单一读码框架编码RNA依赖的RNA聚合酶；M片段全长为3378个核苷酸，含有单一的读码框架，编码1073个氨基酸的糖蛋白前体；S片段是一个双义RNA，基因组以双向的方式编码病毒核蛋白（NP）和非结构蛋白[11]。卢静等对SFTSV结构和非结构蛋白的表达研究发现，NP蛋白抗原性很强，SFTS病人血清中NP特异性抗体可能为主要抗体。而NSs患者血清中不诱导产生抗体或仅产生极少的抗体，很难被检测到[12]。

本次研究的两个病例从流行病学上看，均为来自安徽农村，但是序列分析结果显示其来源可能不同。0428株（安庆）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性与安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均达到99%。而0507株（滁州）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白与AHL/China/2011同源性分别仅为95%、95%、96%，而与江苏株JS2011-013-1的同源性高达99%。地理位置上看，滁州为苏皖交汇地区，与南京接壤，因此来自滁州的患者感染的布尼亚病毒可能来自江苏，因而与江苏代表株的同源性最高[13-15]。

此外，序列分析结果还提示，不同来源的SFTSV的RNA依赖RNA聚合酶（RNA-P）和糖蛋白基因存在一定差异，且其差异的显著性优于NS基因。本研究为本地区SFTSV分子流行病学研究提供了基础。

参考文献

[1]吕沐天，孙颖，刘沛，等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展[J].微生物学杂志，2013，33（2）：86-88.

[2]郭彦萍，王晓南，邢学森，等.新型布尼亚病毒的流行特点及实验室诊断[J].现代预防医学，2013，40（21）：4048-4050.

[3]王庆奎，葛恒明，李志锋，等.从革螨和恙螨中检测到发热伴血小板减少综合征病毒核酸[J].中国媒介生物学及控制杂志，2012，23（5）：452-454.

[4]沈爱华，鲍昌俊，胡建利，等.6例人感染新型布尼亚病毒病的临床特征和流行病学调查分析[J].东南大学学报：医学版，2012，31（5）：559-563.

[5]李世波，薛川，丁贤君，等.浙江地区散发新型布尼亚病毒感染患者的临床特点及其基因序列[J].中华传染病杂志，2012，30（5）：268-272.

[6]中华人民共和国卫生部.发热伴血小板减少综合征防治指南（2010版）[J].中华临床感染病杂志，2011，4（4）：1-2.

[7]Zhang Y Z， Zhou D J， Xiong Yw， et al. Hemorrhagic fever caused by a novel tick-borne Bunyavirus in Huaiyangshan， China [J]. Chin J Epidemiol，2011，32（3）：209-220.

[8]胡建利，鲍昌俊，祁贤，等.20例人感染新型布尼亚病毒病的临床和流行病学特征分析[J].中国人兽共患病学报，2012，28（3）：302-305.

[9]陈华忠，王金富，梁伟峰，等.浙江省首例新型布尼亚病毒感染患者的流行病学调查[J].国际流行病学传染病学杂志，2012，38（5）：360-360.

[10]李世波，薛川，丁贤君，等.浙江地区散发新型布尼亚病毒感染患者的临床特点及其基因序列[J].中华传染病杂志，2012，30（5）：268-272.

[11]许汴利.新布尼亚病毒感染致发热伴血小板减少综合征的发现、认识与启示[J].中华预防医学杂志，2012，46（2）：99-102.

[12]卢静，李川，李福顺，等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究[J].病毒学报，2011，1（6）：515-520.

[13]孙永，张永根，胡万富，等.新型布尼亚病毒安徽分离株全基因组测序分析[J].安徽预防医学杂志，2013，1（6）：403-405.

[14] Li S， Xue C， Fu Y， et al. Sporadic case infected by severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus in a non-epidemic region of China[J]. Bioscience trends，2011，5（6）：273-276.

[15] Yu X J， Liang M F， Zhang S Y， et al. Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J]. New England Journal of Medicine，2011，364（16）：1523-1532.

（收稿日期：2014-07-14） （本文编辑：王宇）

本次研究的两个病例从流行病学上看，均为来自安徽农村，但是序列分析结果显示其来源可能不同。0428株（安庆）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性与安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均达到99%。而0507株（滁州）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白与AHL/China/2011同源性分别仅为95%、95%、96%，而与江苏株JS2011-013-1的同源性高达99%。地理位置上看，滁州为苏皖交汇地区，与南京接壤，因此来自滁州的患者感染的布尼亚病毒可能来自江苏，因而与江苏代表株的同源性最高[13-15]。

此外，序列分析结果还提示，不同来源的SFTSV的RNA依赖RNA聚合酶（RNA-P）和糖蛋白基因存在一定差异，且其差异的显著性优于NS基因。本研究为本地区SFTSV分子流行病学研究提供了基础。

参考文献

[1]吕沐天，孙颖，刘沛，等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展[J].微生物学杂志，2013，33（2）：86-88.

[2]郭彦萍，王晓南，邢学森，等.新型布尼亚病毒的流行特点及实验室诊断[J].现代预防医学，2013，40（21）：4048-4050.

[3]王庆奎，葛恒明，李志锋，等.从革螨和恙螨中检测到发热伴血小板减少综合征病毒核酸[J].中国媒介生物学及控制杂志，2012，23（5）：452-454.

[4]沈爱华，鲍昌俊，胡建利，等.6例人感染新型布尼亚病毒病的临床特征和流行病学调查分析[J].东南大学学报：医学版，2012，31（5）：559-563.

[5]李世波，薛川，丁贤君，等.浙江地区散发新型布尼亚病毒感染患者的临床特点及其基因序列[J].中华传染病杂志，2012，30（5）：268-272.

[6]中华人民共和国卫生部.发热伴血小板减少综合征防治指南（2010版）[J].中华临床感染病杂志，2011，4（4）：1-2.

[7]Zhang Y Z， Zhou D J， Xiong Yw， et al. Hemorrhagic fever caused by a novel tick-borne Bunyavirus in Huaiyangshan， China [J]. Chin J Epidemiol，2011，32（3）：209-220.

[8]胡建利，鲍昌俊，祁贤，等.20例人感染新型布尼亚病毒病的临床和流行病学特征分析[J].中国人兽共患病学报，2012，28（3）：302-305.

[9]陈华忠，王金富，梁伟峰，等.浙江省首例新型布尼亚病毒感染患者的流行病学调查[J].国际流行病学传染病学杂志，2012，38（5）：360-360.

[10]李世波，薛川，丁贤君，等.浙江地区散发新型布尼亚病毒感染患者的临床特点及其基因序列[J].中华传染病杂志，2012，30（5）：268-272.

[11]许汴利.新布尼亚病毒感染致发热伴血小板减少综合征的发现、认识与启示[J].中华预防医学杂志，2012，46（2）：99-102.

[12]卢静，李川，李福顺，等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究[J].病毒学报，2011，1（6）：515-520.

[13]孙永，张永根，胡万富，等.新型布尼亚病毒安徽分离株全基因组测序分析[J].安徽预防医学杂志，2013，1（6）：403-405.

[14] Li S， Xue C， Fu Y， et al. Sporadic case infected by severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus in a non-epidemic region of China[J]. Bioscience trends，2011，5（6）：273-276.

[15] Yu X J， Liang M F， Zhang S Y， et al. Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J]. New England Journal of Medicine，2011，364（16）：1523-1532.

（收稿日期：2014-07-14） （本文编辑：王宇）

本次研究的两个病例从流行病学上看，均为来自安徽农村，但是序列分析结果显示其来源可能不同。0428株（安庆）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白的同源性与安徽代表株AHL/China/2011的同源性最高，均达到99%。而0507株（滁州）的RNA多聚酶、糖蛋白、NS蛋白与AHL/China/2011同源性分别仅为95%、95%、96%，而与江苏株JS2011-013-1的同源性高达99%。地理位置上看，滁州为苏皖交汇地区，与南京接壤，因此来自滁州的患者感染的布尼亚病毒可能来自江苏，因而与江苏代表株的同源性最高[13-15]。

此外，序列分析结果还提示，不同来源的SFTSV的RNA依赖RNA聚合酶（RNA-P）和糖蛋白基因存在一定差异，且其差异的显著性优于NS基因。本研究为本地区SFTSV分子流行病学研究提供了基础。

参考文献

[1]吕沐天，孙颖，刘沛，等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒研究进展[J].微生物学杂志，2013，33（2）：86-88.

[2]郭彦萍，王晓南，邢学森，等.新型布尼亚病毒的流行特点及实验室诊断[J].现代预防医学，2013，40（21）：4048-4050.

[3]王庆奎，葛恒明，李志锋，等.从革螨和恙螨中检测到发热伴血小板减少综合征病毒核酸[J].中国媒介生物学及控制杂志，2012，23（5）：452-454.

[4]沈爱华，鲍昌俊，胡建利，等.6例人感染新型布尼亚病毒病的临床特征和流行病学调查分析[J].东南大学学报：医学版，2012，31（5）：559-563.

[5]李世波，薛川，丁贤君，等.浙江地区散发新型布尼亚病毒感染患者的临床特点及其基因序列[J].中华传染病杂志，2012，30（5）：268-272.

[6]中华人民共和国卫生部.发热伴血小板减少综合征防治指南（2010版）[J].中华临床感染病杂志，2011，4（4）：1-2.

[7]Zhang Y Z， Zhou D J， Xiong Yw， et al. Hemorrhagic fever caused by a novel tick-borne Bunyavirus in Huaiyangshan， China [J]. Chin J Epidemiol，2011，32（3）：209-220.

[8]胡建利，鲍昌俊，祁贤，等.20例人感染新型布尼亚病毒病的临床和流行病学特征分析[J].中国人兽共患病学报，2012，28（3）：302-305.

[9]陈华忠，王金富，梁伟峰，等.浙江省首例新型布尼亚病毒感染患者的流行病学调查[J].国际流行病学传染病学杂志，2012，38（5）：360-360.

[10]李世波，薛川，丁贤君，等.浙江地区散发新型布尼亚病毒感染患者的临床特点及其基因序列[J].中华传染病杂志，2012，30（5）：268-272.

[11]许汴利.新布尼亚病毒感染致发热伴血小板减少综合征的发现、认识与启示[J].中华预防医学杂志，2012，46（2）：99-102.

[12]卢静，李川，李福顺，等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究[J].病毒学报，2011，1（6）：515-520.

[13]孙永，张永根，胡万富，等.新型布尼亚病毒安徽分离株全基因组测序分析[J].安徽预防医学杂志，2013，1（6）：403-405.

[14] Li S， Xue C， Fu Y， et al. Sporadic case infected by severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus in a non-epidemic region of China[J]. Bioscience trends，2011，5（6）：273-276.

[15] Yu X J， Liang M F， Zhang S Y， et al. Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J]. New England Journal of Medicine，2011，364（16）：1523-1532.

（收稿日期：2014-07-14） （本文编辑：王宇）