棉蚜吡虫啉、啶虫脒不同品系解毒酶活性测定和增效剂作用的研究

郭天凤，史雪岩，高希武，刘晓宁

(1.中国农业大学昆虫系，北京100193，2.新疆生产建设兵团第七师农科所，新疆奎屯 833200;3.新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源与基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046)

棉蚜Aphis gossypii 寄主范围广泛，世代周期短，繁殖率高，世代重叠，有无性生殖和有性生殖两种生殖方式，在棉花生长季节主要营孤雌生殖，属于r-对策害虫。目前对棉蚜具有较好防治效果的杀虫药剂主要是新烟碱类杀虫剂吡虫啉和啶虫脒等。近几年来，随着吡虫啉和啶虫脒的广泛使用，棉蚜对吡虫啉和啶虫脒的抗药性问题，引起了普遍的关注。

在靶标抗性、穿透抗性以及代谢抗性等多种昆虫的抗药性机制中，昆虫解毒酶代谢能力增强所导致的代谢抗性是昆虫对杀虫药剂产生抗性的重要机制之一(邢剑飞等，2010)。昆虫体内的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)以及多功能氧化酶(MFO)等作为重要的解毒酶，其活性的增加及变化是导致昆虫抗药性产生的主要原因。

增效剂是生物解毒代谢酶的有效抑制剂，如增效醚(PBO)是昆虫体内多功能氧化酶(MFO)的抑制剂，顺丁烯二酸二乙酯(DEM)是谷胱甘肽转移酶的特异性抑制剂，磷酸三苯酯(TPP)是酯酶(Est)的专一性抑制剂。在杀虫药剂中添加适量的增效剂后，可对害虫中解毒代谢酶产生抑制作用，从而显著提高杀虫剂的杀虫效果。增效剂的使用，对于减少杀虫药剂的用量，降低生产和使用杀虫剂成本，以及降低杀虫药剂的抗性风险，对害虫的抗药性进行有效的治理，均十分重要(陈召亮等，2007)。

昆虫对杀虫药剂的代谢抗性与昆虫体内多种解毒酶的活性变化具有密切的关系。为了有效延缓棉蚜对吡虫啉和啶虫脒抗性的产生，保证吡虫啉和啶虫脒在棉蚜防治中的长期有效使用，掌握棉蚜解毒代谢酶活性变化与其对吡虫啉和啶虫脒抗性形成之间的关系，具有重要的意义。因此，本工作在室内筛选了棉蚜抗、感吡虫啉及啶虫脒品系的基础上，比较了棉蚜吡虫啉、啶虫脒抗性品系和敏感品系的羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶 (GSTs)和细胞色素 P450sO-脱乙基(ECOD)酶的比活力差异，对棉蚜抗吡虫啉和啶虫脒的生物化学机制进行了初步研究。同时，为了掌握各种解毒酶变化在棉蚜对吡虫啉抗性形成中的作用，本工作通过分别使用酯酶、P450 单加氧酶和谷胱甘肽S-转移酶的抑制剂TPP、PBO 和DEM为增效剂，研究了增效剂在吡虫啉、啶虫脒对棉蚜抗、感品系毒力中的增效作用，为使用吡虫啉、啶虫脒，以及结合增效剂进行抗性棉蚜治理，提供了必要的研究数据。本研究对于制定合理有效的棉蚜抗性治理措施，具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

SP-2000UV 型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);数显恒温水浴锅(北京市医疗设备总厂);5417C/R 型台式高速冷冻离心机(Eppendorf，Germany);YKH-I 型液体快速混合器(江西医疗器械厂);HZQ-C 型空气浴恒温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);LS55 Luminescence Spectrometer 荧光分光光度计(Perkin Elmer)

1.2 试虫来源、药剂及来源

试虫来源:

实验室筛选的吡虫啉抗性和敏感品系(抗性倍数是83.27 倍);

实验室筛选的啶虫脒抗性和敏感品系(抗性倍数是82.33 倍)。

药剂及来源:

96.0%吡虫啉原药和98.5%啶虫脒原药(山东联合化工厂股份有限公司生产);

α-乙酸萘酯(α-naphthyl acetate，α-NA)，毒扁豆碱(eserine)，由Fluka 公司提供;1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobezene，CDNB)，1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobezene，CDNB)，还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，二硫苏糖醇(1，4-Dithiothreitol，DTT)，7-乙氧基香豆素 (7-ethoxycoumarin，7-EC)，苯甲基 磺酰氟(phenylmethylsulfonyl，PMSF)，考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue G-250)，固蓝B 盐(fast blue B salt)，十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate，SDS)，牛血清蛋白(bovine serum albumi，BSA)，由美国Sigma 公司提供;乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、甘油(glycerol)、KH2PO4及Na2HPO4均为分析纯，由北京化学试剂公司提供;98%增效醚(piperonyl buoxide，PBO)，由美国Chem Service 公司提供;顺丁烯二酸二乙酯 (Diethyl maleate，DEM)，由美国Chem Service 公司提供;磷酸三苯酯(Triphenylphosphate，TPP)，由美国New Jersey 公司提供。

1.3 吡虫啉、啶虫脒对棉蚜毒力生物测定

吡虫啉、啶虫脒对棉蚜的毒力测定，仿Moores 等(1996)的方法进行，并加以改进。

1.4 增效剂试验

首先测定获得PBO、DEF、DEM 对抗性和敏感品系棉蚜无致死作用的最高浓度 (分别为100 mg/L，50 mg/L 和50 mg/L)，以确保对照组的对照效果。然后采摘种植的非转基因无虫棉花叶片，用打孔器将棉花叶片打孔。将其浸入无致死的最高浓度增效剂中浸30 s 后取出，置阴凉通风处晾干，放入底层铺有1 mL 1%琼脂凝胶的烧杯中。用毛笔小心将无翅成蚜接入叶片上，饲养12 h 后，将此经增效剂处理的棉蚜按1.3的方法，进行吡虫啉、啶虫脒对棉蚜毒力的生物测定。增效值用Bradford (1976)的方法计算增效比，(SR)=单一药剂对棉蚜的LC50值/药剂对增效剂处理的棉蚜的LC50值。

1.5 棉蚜中3 种解毒酶比活力的测定

1.5.1 棉蚜羧酸酯酶活性测定

(1)酶液制备:挑取抗性、敏感无翅成蚜300头，加入1 mL 0.4 M 磷酸缓冲液，充分匀浆，10080 rpm 离心15 min，取上清液作为母液，重复3 次，-80℃冷冻保存。

(2)活性测定:参照Van Aspern (1962)的方法并加以修改。取3 只试管，在每个试管中依次加入0.45 mL 磷酸缓冲液(0.04 M，pH7.0)、1.8 mL 3×10-4M α-NA (α-NA:毒扁豆碱1∶1)、0.05 mL 酶液。30℃反应15 min 后，加入显色剂(1%固蓝B 盐:5%SDS，2∶5 显色剂)终止反应并显色，静置5-10 min 后在600 nm 下测定吸光值。对照管中不加酶液，于加入显色剂之后补加0.05 mL 酶液。每个处理重复三次，每个重复三次测定。根据得出的吸光值(OD)平均值和测得的酶液的蛋白含量，求出羧酸酯酶的比活力。

1.5.2 棉蚜谷胱甘肽S-转移酶比活力测定

(1)酶液制备:称取约50-60 mg 棉蚜成虫，于冰浴中加入2 mL pH6.5的磷酸缓冲液进行匀浆，10000 g 4℃下离心30 min，取上清作为粗酶液，重复3 次，-80℃冻存备用。

(2)活性测定:参照Habig 等(1981)方法进行。反应体系总体积为900μL，依次加入pH 6.5的磷酸缓冲液0.64 mL、0.03 mL 30 mM 还原型谷胱甘肽(GSH)作底物、粗酶液0.2 mL 及0.03 mL 30 mM 1-氯-2，4-二硝基 苯(CDNB)，于340 nm 波长下记录2 min 内的吸光值变化。每个实验设三次独立重复，每次重复平行测定三次。根据得出的吸光值(OD)平均变化值和测得的酶液的蛋白含量，求出谷胱甘肽S-转移酶的比活力。

1.5.3 细胞色素P450-O-脱乙基比活力测定

(1)酶液制备:称取约200 mg 棉蚜成虫，冰浴匀浆，匀浆液为pH7.5 磷酸缓冲液(含0.4 M DTT、0.4 M PMSF、20%甘油)。10000 g 4℃下离心约20 min，取上清作为粗酶液，并用7-8 层滤纸过滤后立即用于反应测定。

(2)活性测定:主要参照Aitio (1978)的方法测定棉蚜7-乙氧基香豆素O-脱乙基(ECOD)比活力。在650μL 0.1 M pH7.0 Tris-HCl 缓冲液中，加入底物6μL 10 mM 7-乙氧基香豆素，加入6μL 12 mM NADPH 以启动反应，加入粗酶液250μL。于35℃下反应15 min，加入15% TCA 300μL终止反应后，加入450μL Gly-NaOH。用荧光分光光度计测定酶反应产物7-羟基香豆素的荧光值。检测条件:发射光波长456 nm，激发光波长368 nm。每个实验设三次独立重复，每次重复平行测定三次。

1.6 数据统计与分析

所得数据用POLO 软件(LeOra Software Inc.，California，USA)或SAS 软件计算毒力回归方程的斜率值(Slope ±SE)，LC50及其95%置信限及卡方值等。采用EXCEL 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 TPP、PBO 和DEM 在吡虫啉敏感和抗性棉蚜品系中对吡虫啉毒力的增效比

从表1 可知，吡虫啉对棉蚜吡虫啉敏感和抗性品系的LC50分别为0.176 和14.657 mg/L。TPP、PBO 和DEM 在吡虫啉敏感品系中对吡虫啉毒力的增效比分别为1.12、1.09、0.97，而在吡虫啉抗性品系中的增效比分别为2.02、1.75、1.05，可见，除DEM 外，TPP 和PBO 在棉蚜吡虫啉敏感和抗性品系中对吡虫啉的毒力均有明显的增效作用，且在抗性品系中的增效作用显著高于敏感品系，其中TPP 对抗性棉蚜的增效比大于2。

表1 增效剂PBO、DEM、TPP 在吡虫啉敏感SS 和抗性RR 棉蚜品系中对吡虫啉毒力的增效作用Table 1 Synergistic effects of PBO，DEF and TPP on imidacloprid in the SS and RR stains ofcotton aphid (Aphids gossypii)

2.2 TPP、PBO 和DEM 在啶虫脒敏感和抗性棉蚜品系中对啶虫脒毒力的增效比

从表2 可以看出，啶虫脒棉蚜啶虫脒敏感和抗性品系的LC50分别为0.18 和14.819 mg/L。TPP、PBO 和DEM 在啶虫脒敏感棉蚜品系中对啶虫脒毒力的增效比仅为1.02、1.03、1.02，在啶虫脒抗性棉蚜品系中对啶虫脒毒力的增效比为1.77、1.61、1.04，可见，除DEM 外，TPP 和PBO 在棉蚜啶虫脒敏感和抗性品系中对啶虫脒的毒力均有明显的增效作用，且在抗性品系中的增效作用显著高于敏感品系，其中TPP 对抗性棉蚜的增效比大于1.77。

2.3 吡虫啉、啶虫脒抗性品系和敏感品系棉蚜中解毒酶比活力比较

从表3 可以看出，吡虫啉抗性品系和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶活性差异非常显著，棉蚜抗吡虫啉品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的3.26 倍。说明棉蚜对吡虫啉的抗性形成与羧酸酯酶活性的增强有关。抗吡虫啉棉蚜品系的细胞色素P450-O-脱乙基酶活性是敏感品系的1.60 倍，表明棉蚜对吡虫啉的抗性形成与棉蚜细胞色素P450s O-脱乙基活性的增加具有一定的关系。抗吡虫啉棉蚜品系的谷胱甘肽S-转移酶活性是敏感品系的1.08 倍，表明棉蚜对吡虫啉的抗性形成与棉蚜谷胱甘肽S-转移酶的关系不大。

表2 增效剂PBO、DEM、TPP 在敏感SS 和抗性RR 棉蚜品系中对啶虫脒毒力的增效作用Table 2 Synergistic effects of PBO，DEF and TPP on acetamiprid in the SS and RR stains of cotton aphid (Aphids gossypii)

表3 吡虫啉抗性和敏感棉蚜品系3 种解毒酶比活力的比较Table 3 Activities of the detoxification enzymes from susceptible and resistance strains of Aphis gossypii to imidacloprid

表4的结果可以看出，啶虫脒抗性品系和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶活性差异非常显著，棉蚜抗啶虫脒品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的2.91 倍，棉蚜对啶虫脒的抗性形成与羧酸酯酶活性的增强有关。抗啶虫脒棉蚜品系的细胞色素P450-O-脱乙基酶活性是敏感品系的1.69 倍，表明棉蚜对啶虫脒的抗性形成与棉蚜细胞色素P450s O-脱乙基活性的增加具有一定的关系。抗啶虫脒棉蚜品系的谷胱甘肽S-转移酶活性是敏感品系的1.04 倍，表明棉蚜对啶虫脒的抗性形成与棉蚜谷胱甘肽S-转移酶的关系不大。

表4 啶虫脒抗性和敏感棉蚜品系3 种解毒酶比活力的比较Table 4 Activities of the detoxification enzymes from susceptible and resistance strains of Aphis gossypii to acetamiprid

3 讨论与结论

本研究利用室内筛选获得的吡虫啉、啶虫脒抗性和敏感品系，研究了增效剂的增效作用，发现TPP 和PBO 在吡虫啉和啶虫脒敏感品系棉蚜中增效作用不明显，但在抗性品系中的增效作用显著。TPP 和PBO 在吡虫啉抗性品系棉蚜中的增效比为2.02 和1.75，在啶虫脒抗性品系棉蚜中的增效比为1.77 和1.61。可见，羧酸酯酶及细胞色素P450 酶活性的变化是棉蚜对吡虫啉及啶虫脒产生抗性的主要原因之一。

在杀虫剂的选择压力下，昆虫羧酸酯酶产生了相应的进化的反应，导致抗性昆虫中羧酸酯酶活性有所增高，是一种重要的抗性机制。如昆虫中羧酸酯酶活性增高，引起了害虫对有机磷杀虫剂抗性的产生。这些在库蚊Culex (Hemingwayetal et al.，2004)，褐飞虱Nilaparvata lugens (Small and Hemingway，2000)，桃蚜Myzus persicae (Field et al.，1999)，棉蚜Aphis gossypii Glover (Cao et al.，2008;Pan et al.，2009)，东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis (Zhang et al.，2011)中都有发现。本研究结果表明，棉蚜吡虫啉、啶虫脒抗性品系和敏感品系的羧酸酯酶活性差异非常显著。棉蚜抗性吡虫啉和啶虫脒品系的羧酸酯酶活性是敏感品系的3.26 和2.91 倍。因此，棉蚜对吡虫啉、啶虫脒的抗性形成与其羧酸酯酶活性的增强，也有着非常密切的关系。

P450 单加氧酶活力升高是多种害虫对吡虫啉产生抗性的普遍机制，在多种抗吡虫啉害虫中均有发现。细胞色素P450 单加氧酶是参与外源性化学物质包括杀虫剂解毒的重要代谢酶系。细胞色素P450 单加氧酶活性的提高，增强了昆虫对拟除虫菊酯和新烟碱类杀虫剂的抗药性，这种抗性机制在淡色库蚊Culex pipiens pallens、德国小蠊Blattella germanica、小菜蛾Plutella xyllostella、烟粉虱Bemisia tabaci、赤拟谷盗Tribolium castaneum Herbst、桃蚜Myzus persicae的研究中均有报道(Shen et al.，2003;Pridgeon et al.，2003;Bautista et al.，2009;Karunkeretal et al.，2008;Zhu et al.，2010;Puinean et al.，2010)。

细胞色素P450 单加氧酶通过降低杀虫剂的杀虫效果，而表现为害虫对有机磷杀虫剂抗性的产生。如Sato 等 (2001，2007)报道了细胞色素P450 单加氧酶的氧化代谢机制，是捕食性钝绥螨对杀扑磷抗性的产生的机制。家蝇CYP6A1 基因转录的增加，导致了其对杀虫剂二嗪农抗性的产生(李芬等，2012)。本研究表明，棉蚜对吡虫啉、啶虫脒抗性品系的细胞色素P450-O-脱乙基酶的活性显著高于敏感品系，分别是敏感品系的1.60 倍和1.69 倍，说明细胞色素P450-O-脱乙基酶的活性升高，也会降低吡虫啉和啶虫脒杀虫效果，从而引发棉蚜抗性的产生。

吡虫啉、啶虫脒抗性棉蚜品系中羧酸酯酶活性、细胞色素P450-O-脱乙基酶活性，均明显高于敏感品系。增效剂的增效作用实验和解毒酶活力比较表明，羧酸酯酶和多功能氧化酶在棉蚜对吡虫啉、啶虫脒抗性产生中，发挥了重要作用，谷胱甘肽-S-转移酶仅起到了一定辅助作用。在棉花生产中，应继续利用农业、生物、物理防治等相结合的综防技术，交替使用作用机制不同的杀虫剂，利用增效剂对酯酶和P450 单加氧酶活性产生的抑制作用，加入增效剂来提高防治效果，减少农药的使用量和使用次数并延缓其抗药性发展。

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