益母草提取物对阿霉素心肌损伤的防护作用

陈瑜萍

摘 要 目的：研究益母草提取物对阿霉素所致的心肌受损细胞的保护作用。方法：以MTT法将H9C2心肌细胞置于（36.5±0.5）℃， 95%空气加5%二氧化碳混合气体中培养。实验组心肌细胞培养液中加益母草提取液和阿霉素；对照组加阿霉素；对照空白组两者都不加。结果：实验组细胞存活率为63.4%，对照组细胞存活率为48.5%，组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论：益母草提取物对阿霉素所致的心肌受损细胞具有保护作用。

关键词 益母草 阿霉素 心肌损伤

中图分类号：R285.5 文献标识码：B 文章编号：1006-1533（2014）21-0052-03

The protective effect of the extracts of Leonurus artemisia

on the adriamycin-induced myocardial injury

CHEN Yuping

（Kangjian Community Health Service of Xuhui District， Shanghai 200233， China）

ABSTRACT Objective： To study the cytoprotective effect of the extracts of Leonurus artemisia on adriamycin-induced myocardial damage. Methods： Myocardial H9C2 cells were cultivated at （36.5±0.5） ℃ in an incubator with 95% air and 5% carbon dioxide based on MTT assay and the extracts of Leonurus artemisia were added into the broth of myocardial cells in the experimental group， while only adriamycin in the control group and neither the extracts of Leonurus artemisia nor adriamycin in the blank control group and then cells were incubated for 24 hours at 37 ℃. Results： The survival rate of cells was 63.4% in the experimental group while only 48.5% in the control group （P<0.05）. Conclusion： The extracts of Leonurus artemisia have a protective effect on adriamycin-induced myocardial injury cells.

KEY WORDS Leonurus artemisia；adriamycin；myocardial injury

阿霉素（ adriamycin， ADM）是抗肿瘤药物，抗肿瘤谱广，疗效显著，但是，阿霉素具有一定的心脏毒性。益母草（Leonurus heterophyllus， LH）有效成分为LH 碱等生物碱，其功用主治为活血化瘀、利尿、调经，临床上主要用于妇产科。近期研究认为，益母草的药理作用是多方面的，临床上有用于冠心病心肌缺血取得良好效果的报道。我们研究了益母草对阿霉素造成的心肌缺血及再灌注损伤的作用，结果如下。

材料与方法

材料

细胞及试剂

H9C2心肌细胞，磷酸盐缓冲液（PBS），噻唑兰试剂（MTT），4%多聚甲醛，Hoechst 33258染色液，二甲基亚砜（DMSO），DMEM培养基。

仪器

荧光显微镜（Leica），酶标仪（Infinire Mzoo型，TECAN公司），CO2孵箱（Thermo Electron Corporation型，JOUAN公司）。

方法

细胞培养

将H9C2心肌细胞置于pH为7.2～7.4，温度为（36.5±0.5）℃，95%空气加5%二氧化碳混合气体的环境中培养。

实验分组

将实验分为3组：空白对照组为没有加入阿霉素和益母草提取物的细胞组，对照组为加入1 μmol/L阿霉素的细胞组，实验组为先加入100 μg/ml的益母草提取物后再加入1 μmol/L的阿霉素的细胞组。

MTT法

将H9C2细胞加入96孔培养板，每孔4 000个细胞，培养24 h，去血清，在37 ℃孵箱下继续培养24 h ，加入益母草，1 h后再加入1 μmol/L的阿霉素，培养24 h，每孔加入10 μl含5 mg/ml 的MTT，4 h后加入150 μl的二甲基亚砜。在酶标仪上波长490 nm下测定OD值，每组通过筛选后各留下8个OD值。

Hoechst 33258细胞核染色

取洁净载玻片在70%乙醇中浸泡5 min或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS或0.9% NaCl溶液洗涤3遍，再用细胞培养液洗涤1遍，将载玻片置于6孔板内，种入细胞培养过夜。刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，固定15 min或更长时间（可4 ℃过夜）。去固定液，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸尽液体。洗涤时用摇床或手动晃动，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色30 min。去染色液，用PBS或0.9% NaCl洗2遍，每次3 min，吸尽液体。洗涤时用摇床或手动晃动，加1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的载玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞液，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。

统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件，计量资料采用卡方检验，计数资料采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

MTT法实验结果

用酶标仪检测各组细胞的吸光值A570和 A490， 以 A570/A490代表细胞活力，空白对照组细胞存活率为 100%，其余各组按存活率 = （各浓度组吸光值 /空白对照组吸光值） ×100%与之比较。阿霉素对照组平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物组平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258细胞核染色实验结果

3个组在400倍的荧光显微镜观察到的结果见图1。

从图1中我们可以看见，A为正常细胞，有椭圆形的细胞核；B为加入阿霉素的细胞， 细胞核发生固缩，呈典型的凋亡改变； C则显示通过益母草提取物的加入，细胞的受损程度远好于B组，说明益母草提取物的加入对阿霉素的心肌受损细胞具有保护作用。

讨论

本实验提示，仅加阿霉素的心肌细胞平均存活率为48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌细胞平均存活率为63.4%，比前者高。从Hoechst 33258细胞核染色实验结果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌细胞的受损程度比不加益母草提取物的细胞要低， 这就说明了益母草提取物的加入对心肌细胞的存活是有帮助的，能明显降低心肌细胞的死亡率。

从文献[1]来看，阿霉素的心脏毒性是由其半醒自由基介导的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂质过氧化反应增强，损伤细胞膜及细胞器膜，改变膜上蛋白质的功能及酶的活性，导致细胞内钙超载，核酸、蛋白质合成受抑制，能量代谢障碍，严重影响心肌的收缩及舒张功能。益母草主要成分为益母草碱， 具有调经活血、兴奋子宫等作用， 主要用于妇科疾病。近年来许多研究表明，益母草的药理作用是多方面的。益母草注射液试用于治疗冠心病已有文献报道[2]。临床研究[3]及实验研究均表明， 心肌缺血可使机体脂质过氧化反应增强， 血浆丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血浆MDA升幅低于阿霉素组， 全血谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素组， 说明益母草对清除自由基系统酶的活性有保护作用， 可减少脂质过氧化反应， 减轻心肌细胞膜由氧自由基引发的损伤， 减低细胞膜的通透性， 从而减少心肌细胞内心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌细胞内，减轻心肌细胞内Ca2+ 超载引起的细胞损伤。本实验的结果亦显示，益母草提取物对阿霉素的心肌损伤有明显保护作用。

参考文献

夏腊梅， 伍杰雄. 川芎嗪对大鼠心肌线粒体损伤的保护作用[J]. 中国药房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何锡文. 复方生脉饮对羟自由基的清除作用研究[J]. 中国中药杂志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力体保对阿霉素所致大鼠心肌线粒体毒性的保护作用[J]. 中华医学研究杂志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）

统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件，计量资料采用卡方检验，计数资料采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

MTT法实验结果

用酶标仪检测各组细胞的吸光值A570和 A490， 以 A570/A490代表细胞活力，空白对照组细胞存活率为 100%，其余各组按存活率 = （各浓度组吸光值 /空白对照组吸光值） ×100%与之比较。阿霉素对照组平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物组平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258细胞核染色实验结果

3个组在400倍的荧光显微镜观察到的结果见图1。

从图1中我们可以看见，A为正常细胞，有椭圆形的细胞核；B为加入阿霉素的细胞， 细胞核发生固缩，呈典型的凋亡改变； C则显示通过益母草提取物的加入，细胞的受损程度远好于B组，说明益母草提取物的加入对阿霉素的心肌受损细胞具有保护作用。

讨论

本实验提示，仅加阿霉素的心肌细胞平均存活率为48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌细胞平均存活率为63.4%，比前者高。从Hoechst 33258细胞核染色实验结果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌细胞的受损程度比不加益母草提取物的细胞要低， 这就说明了益母草提取物的加入对心肌细胞的存活是有帮助的，能明显降低心肌细胞的死亡率。

从文献[1]来看，阿霉素的心脏毒性是由其半醒自由基介导的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂质过氧化反应增强，损伤细胞膜及细胞器膜，改变膜上蛋白质的功能及酶的活性，导致细胞内钙超载，核酸、蛋白质合成受抑制，能量代谢障碍，严重影响心肌的收缩及舒张功能。益母草主要成分为益母草碱， 具有调经活血、兴奋子宫等作用， 主要用于妇科疾病。近年来许多研究表明，益母草的药理作用是多方面的。益母草注射液试用于治疗冠心病已有文献报道[2]。临床研究[3]及实验研究均表明， 心肌缺血可使机体脂质过氧化反应增强， 血浆丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血浆MDA升幅低于阿霉素组， 全血谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素组， 说明益母草对清除自由基系统酶的活性有保护作用， 可减少脂质过氧化反应， 减轻心肌细胞膜由氧自由基引发的损伤， 减低细胞膜的通透性， 从而减少心肌细胞内心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌细胞内，减轻心肌细胞内Ca2+ 超载引起的细胞损伤。本实验的结果亦显示，益母草提取物对阿霉素的心肌损伤有明显保护作用。

参考文献

夏腊梅， 伍杰雄. 川芎嗪对大鼠心肌线粒体损伤的保护作用[J]. 中国药房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何锡文. 复方生脉饮对羟自由基的清除作用研究[J]. 中国中药杂志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力体保对阿霉素所致大鼠心肌线粒体毒性的保护作用[J]. 中华医学研究杂志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）

统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件，计量资料采用卡方检验，计数资料采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

MTT法实验结果

用酶标仪检测各组细胞的吸光值A570和 A490， 以 A570/A490代表细胞活力，空白对照组细胞存活率为 100%，其余各组按存活率 = （各浓度组吸光值 /空白对照组吸光值） ×100%与之比较。阿霉素对照组平均存活率=（0.278/0.573）×100%=48.5%，益母草提取物组平均存活率=（0.364/0.573）×100%=63.4%，两组比较差异有统计学意义（P<0.05，表1）。

Hoechst 33258细胞核染色实验结果

3个组在400倍的荧光显微镜观察到的结果见图1。

从图1中我们可以看见，A为正常细胞，有椭圆形的细胞核；B为加入阿霉素的细胞， 细胞核发生固缩，呈典型的凋亡改变； C则显示通过益母草提取物的加入，细胞的受损程度远好于B组，说明益母草提取物的加入对阿霉素的心肌受损细胞具有保护作用。

讨论

本实验提示，仅加阿霉素的心肌细胞平均存活率为48.5%，而加有益母草提取物后再加阿霉素的心肌细胞平均存活率为63.4%，比前者高。从Hoechst 33258细胞核染色实验结果可以得到，加有益母草提取物的阿霉素心肌细胞的受损程度比不加益母草提取物的细胞要低， 这就说明了益母草提取物的加入对心肌细胞的存活是有帮助的，能明显降低心肌细胞的死亡率。

从文献[1]来看，阿霉素的心脏毒性是由其半醒自由基介导的氧自由基的毒害引起的，阿霉素可致脂质过氧化反应增强，损伤细胞膜及细胞器膜，改变膜上蛋白质的功能及酶的活性，导致细胞内钙超载，核酸、蛋白质合成受抑制，能量代谢障碍，严重影响心肌的收缩及舒张功能。益母草主要成分为益母草碱， 具有调经活血、兴奋子宫等作用， 主要用于妇科疾病。近年来许多研究表明，益母草的药理作用是多方面的。益母草注射液试用于治疗冠心病已有文献报道[2]。临床研究[3]及实验研究均表明， 心肌缺血可使机体脂质过氧化反应增强， 血浆丙二醛（MDA）升高。加入益母草后血浆MDA升幅低于阿霉素组， 全血谷胱甘肽过氧化物酶（GSH Px）高于阿霉素组， 说明益母草对清除自由基系统酶的活性有保护作用， 可减少脂质过氧化反应， 减轻心肌细胞膜由氧自由基引发的损伤， 减低细胞膜的通透性， 从而减少心肌细胞内心肌酶的漏出以及Ca2+ 流入心肌细胞内，减轻心肌细胞内Ca2+ 超载引起的细胞损伤。本实验的结果亦显示，益母草提取物对阿霉素的心肌损伤有明显保护作用。

参考文献

夏腊梅， 伍杰雄. 川芎嗪对大鼠心肌线粒体损伤的保护作用[J]. 中国药房， 2002， 13 （7）： 400-403.

王玉秋， 白令君， 何锡文. 复方生脉饮对羟自由基的清除作用研究[J]. 中国中药杂志， 1998， 23 （1）： 45-50.

王旭， 邵一兵， 王正忠， 等. 天力体保对阿霉素所致大鼠心肌线粒体毒性的保护作用[J]. 中华医学研究杂志， 2003， 3（8）： 680-681.

（收稿日期：2014-04-25）