鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量细胞间接免疫荧光方法的建立

李 翠，郭彩云，戴志红，蒋 卉，张秀英，温 芳，陆连寿，王在时

(中国兽医药品监察所，北京100081)

鸡传染性法氏囊病(Infectious of bursal disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious of bursal disease virus，IBDV)引起的一种急性、高度传染性疾病［1］。在我国对该病的主要防治措施是对鸡群进行疫苗免疫，而疫苗质量的好坏直接关乎免疫预防的成败。鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)作为国内最常使用的鸡传染性法氏囊病疫苗，目前主要采用鸡胚半数致死量(ELD50)测定法测定该疫苗的病毒含量以确定其效力［2］。由于SPF鸡胚价格高，且病毒含量测定所需的周期较长，使得检验成本增加，因此建立一种更加经济、快速测定该疫苗病毒含量的方法具有重要意义。

研究发现，鸡传染性法氏囊病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)、Vero细胞等都有很好的适应性［3］，但不产生明显的细胞病变，可以通过荧光染料染色后呈现强烈的荧光。试验采用Vero细胞建立细胞免疫荧光方法，确定了高免血清及二抗适宜稀释浓度、接度量和方法的特异性，并与传统鸡胚半数致死量(ELD50)方法进行了敏感性和相关性比较，细胞免疫荧光方法具有更高的敏感性，且两种方法具有良好的相关性。本研究为今后该疫苗的病毒含量测定提供了一个新途径。

1 材料

1.1 疫苗和细胞 鸡传染性法氏囊病毒为本研究室制备的鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)参考品(批号:S0531111);Vero细胞由华中农业大学实验室赠予;SPF鸡胚，梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂 DMEM培养基、犊牛血清、0.25%胰酶，Gibco公司;0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS);丙酮、甲醇，北京化学试剂公司;鸡传染性法氏囊病阴、阳性血清(批号:2010)，中国兽医药品监察所菌种保藏中心;羊抗鸡IgG(产品编号:bs-0310GAF488)，北京博奥森生物技术有限公司。

2 方法

2.1 病毒接种 将Vero细胞接种48孔细胞培养板，培养至单层，弃去培养液，接种鸡传染性法氏囊病毒液，培养48 h。

2.2 间接免疫荧光(IFA)试验 参照文献［4］进行。一抗为中国兽医药品监察所研制的鸡传染性法氏囊病毒高免血清，二抗为羊抗鸡IgG，同时设阴性血清、生理盐水和不接毒加阳性高免血清三组对照。

2.3 高免血清及二抗适宜稀释浓度的确定 用0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液对羊抗鸡IgG荧光抗体作1∶100、1∶200、1∶300、1∶400 系列稀释，每孔100 μL，分别与用生理盐水作1∶100稀释的鸡传染性法氏囊病高免血清反应，以确定荧光抗体适宜浓度;用生理盐水将鸡传染性法氏囊病高免血清作1∶50、1∶100、1∶200、1∶300 系列稀释，每孔100 μL，分别与适宜浓度的荧光抗体进行反应，以确定鸡传染性法氏囊病高免血清的适宜稀释度。

2.4 接毒量的确定 分别将每0.2 mL病毒含量ELD50值为104.5的疫苗液10倍系列稀释得每0.2 mL 病毒含量 ELD50值为 103.5、102.5、101.5、100.5的稀释液，每孔分别接种0.2、0.1和0.05 mL，各接种三块48孔板，48 h后固定染色，荧光显微镜下观察结果。

2.5 特异性试验 长成单层的Vero细胞，分别接种鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、禽白血病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒，同时设接种鸡传染性法氏囊病毒和正常细胞对照，固定染色，在荧光显微镜下观察。

2.6 敏感性试验 随机抽取5支半数致死量对数值(lgELD50)定值为4.19±0.15的鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)，分别稀释至每0.2 mL病毒含量 ELD50值为 103.5、102.5、101.5、100.5，在单层Vero细胞板上每孔分别接种各稀释度的疫苗液200 μL，各5孔，培养 48 h后，固定染色，在荧光显微镜下观察结果。按Reed法计算TCID50值，并按平均值±标准偏差定值样品的lgTCID50值，以比较两种方法的敏感性。

2.7 ELD50和TCID50方法测定疫苗病毒含量的比较 随机抽取10支鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)，做10倍系列稀释，取适宜稀释度分别定量接种单层Vero细胞和SPF鸡胚，每个稀释度接种5个重复。接毒细胞培养48 h，固定染色，在荧光显微镜下观察结果，“++”及以上结果判为阳性，计算各稀释度出现特异性荧光的百分率。接毒鸡胚培养7 d，观察结果。按Reed法分别计算ELD50值和 TCID50值。并采用 SAS软件对 ELD50值和TCID50值进行相关性分析。

3 结果

3.1 细胞间接免疫荧光方法的建立试验结果 接种0.05 mL病毒含量为102.5ELD50/0.2 mL的细胞孔中无阳性荧光，0.2mL组和0.1 mL组对应各细胞孔荧光无明显差别，因此接毒量选择每孔接种0.1 mL(图1)。

3.2 高免血清及二抗适宜稀释浓度的确定 将高免血清与各稀释度二抗进行棋盘式组合试验，结果表明，1∶200稀释度的高免血清与1∶300稀释度的二抗组合时，观察到的荧光最清晰，而降低或增加高免血清和二抗浓度时，观察到的荧光均不很清晰(图2)。

3.3 特异性试验 鸡传染性法氏囊病毒检测结果为阳性，鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、禽白血病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和正常细胞对照未见荧光，均为阴性。

3.4 敏感性试验 细胞间接免疫荧光方法敏感试验结果见表1，数据结果汇总见表2。

按Reed法计算5支样品的TCID50值，其对数值(lgTCID50)值分别为:5.67、5.60、5.75、5.37、5.56。按平均值±标准偏差定值样品的lgTCID50值结果为:5.59±0.14。与半数致死量的对数值(lgELD50)的定值结果4.19±0.15比较可见，该方法稳定，具有更高的敏感性。

图1 接毒量实验结果

图2 高免血清及二抗适宜稀释浓度的确定

表1 细胞间接免疫荧光敏感性试验结果

表2 细胞间接免疫荧光敏感性试验结果统计

表3 lgELD50与lgTCID50对数值的对比结果

3.5 ELD50值与TCID50值相关性的对比 随机抽取的10支鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)，以传统的ELD50方法与TCID50方法同时测定病毒含量。试验结果见表3。

传统ELD50方法测定值为A组数据，间接免疫荧光TCID50方法测得值为B组数据，A组平均数(Mean)＝3.74，B组平均数(Mean)＝5.54，说明TCID50方法具有更高的检验灵敏度。采用SAS软件对两组数据进行相关性分析［5］，相关系数r＝0.83944，当0.7≤︳r︳≤1为高度相关，因此，传统ELD50方法和间接免疫荧光TCID50方法测定疫苗病毒含量值具有高度的相关性。

4 讨论

研究建立了细胞间接免疫荧光测定鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量的方法，将毒液进行10倍系列稀释，感染单层Vero细胞，加高免血清、羊抗鸡IgG荧光抗体，根据细胞板中荧光斑来判定阴阳性，并计算半数细胞感染量(TCID50)。细胞免疫荧光试验中，高免血清与荧光抗体的浓度确定，对实验结果的判定至关重要。二者的浓度过高会使背景荧光过重，而导致假阳性结果的出现，二者浓度过低，则会使视野内荧光斑数量减少，而导致假阴性结果出现。本研究确定了该方法中高免血清与荧光抗体的适宜浓度，保证实验出现低背景、高荧光斑的结果，利于观察，从而使实验结果客观准确。

研究提供了测定鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量的新方法，确定了特异性，与传统ELD50测定方法进行了敏感性和相关性比较，间接免疫荧光方法定值lgTCID50结果为5.59±0.14，传统鸡胚半数致死量方法定值的lgELD50结果为4.19±0.15，可见间接免疫荧光方法具有更高的敏感性。两种方法的相关性系数r为0.83944，表明间接免疫荧光TCID50方法与传统ELD50方法测定疫苗病毒含量值具有高度的相关性。而且，该方法避免使用鸡胚，降低了检验成本，缩短了检验周期。本研究为该疫苗的检验提供了一个新途径。陶素华［6］等报道不同毒株的鸡传染性法氏囊病毒可适应于Vero细胞，今后可增加相关研究将该方法推广到其他鸡传染性法氏囊病毒疫苗的病毒含量测定。

［1］郑建浩.浅谈鸡传染性法氏囊病的诊断与防治［J］.畜禽业.2008(4):82-83.

［2］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版［S］.

［3］于维军.国外传染性法氏囊病病毒学及免疫学的研究进展［J］.中国畜禽传染病.1990，54(5):55-58.

［4］中国医学科学院流行病防治研究所.常见病病毒实验技术［M］.北京:科学出版社，1978:55.

［5］杨金秀.统计学原理［M］.长沙:中南大学出版社，2007:263.

［6］陶素华，韦 莉，孙延涛，等.鸡传染性法氏囊病病毒适应于Vero细胞的初步研究［J］.中国兽医杂志，1995，21(12):3-5.