ELISA在口蹄疫监测中的应用进展

厍大亮，陈前锋，武革利，厉少汉

(1.杨凌绿方生物工程有限公司，陕西杨凌712100;2.甘肃农业大学动物医学院，兰州730000;3.石家庄市动物疫病预防控制中心，石家庄050000)

口蹄疫病毒(FMDV)有7个血清型，每个型又可分为若干个亚型，血清型间几乎无交叉免疫反应，同型内部不同毒株之间抗原性也有差异，这就给口蹄疫(FMD)的诊断和防治工作带来很大难度。在世界各地，因流行病毒血清型不同，使用的疫苗毒株也不同，流行毒株的抗原变异往往导致免疫失败，同时由于感染动物抗体和免疫动物抗体情况很接近，使得区分免疫动物群体中的感染动物时情况非常复杂［1］。ELISA是最常用于诊断FMD的血清学检测技术，具有灵敏、廉价、快速且易于实现自动化操作等优点，不仅适用于大量临床标本的检测，也适合血清流行病学调查。本文对ELISA方法在FMD诊断、FMDV的血清型和基因型分析、病毒粒子定量等方面国内外近期的研究进展和发展趋势做了论述。

1 ELISA在口蹄疫诊断中的应用

FMD与水疱型疾病很难通过临床诊断加以区分，虽然可以用病毒分离、RT-PCR来诊断，但是费时费力;ELISA操作方便，价格低廉，可以同时检测大量样品，所以ELISA已成为FMD诊断中应用最为广泛的血清学技术之一。

血清多抗经常出现品质不均匀和交叉反应较多的情况，所以使用血清多抗的ELISA很难实现标准化和程序化。与血清多抗相比，单克隆抗体具有均一且特异性强的特点，是建立ELISA的最佳选择。孙静等［2］使用抗A型FMDV单克隆抗体建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA，该方法可以检出2.0 ng的纯化FMDV。Chen等［3］报道了一种单克隆抗体ELISA，此法对O型FMDV非常敏感，而与Asia I、A及C型病毒均不反应。为提高敏感性，近年来出现了能够检测痕量物质的RT-PCR ELISA［4］，这种 ELISA 敏感性极高，对诊断临床症状不明显的感染动物效果很好。

为防止FMDV扩散，过去常使用融合蛋白和多肽代替完整病毒作为抗原建立ELISA。有研究证明［5］，VP1蛋白在ELISA检测中更准确，能将假阳性率降到最低。于军超等［6］用Rosetta菌表达重组VP1作为抗原建立了检测O型FMDV抗体的间接ELISA，此法与液相阻断试剂盒符合率为98.87%。为了扩大试剂盒的应用范围，Yang等［7］制备了针对保守区域1B蛋白N末端的单克隆抗体来开发跨型诊断试剂盒。

融合蛋白虽然避免了散毒风险，但仅有线性表位而缺少构象表位，不能完全代替完整病毒颗粒，而空衣壳含有连续和间断的B细胞表位和T细胞表位，结构与完整病毒极为相似。目前FMDV不同血清型的空衣壳均已通过大肠杆菌或者杆状病毒表达系统获得，Basagoudanavar等［8］通过杆状病毒表达系统获得了A型FMDV结构蛋白，然后在昆虫细胞内组装成空衣壳，用以建立液相阻断ELISA，此法与传统液相阻断ELISA的相关性为89%。作为融合蛋白和病毒颗粒的替代品，空衣壳已成为FMD诊断方法和疫苗研究的新热点。

2 ELISA在区别疫苗免疫动物和感染动物中的应用

近几年来基因工程疫苗被广泛研发，但由于存在诸多问题，商品化的产品比较少。而灭活疫苗效果良好，在发展中国家和地区仍然是防控FMD的最佳工具。一般情况下灭活疫苗在生产过程中的抗原纯化环节除去了绝大部分非结构蛋白，免疫动物几乎不产生非结构蛋白抗体，而自然感染动物既产生非结构蛋白抗体又产生结构蛋白抗体。学者们据此认为检测非结构蛋白抗体对于区别免疫动物与感染动物具有重要意义，于是一些检测FMDV非结构蛋白抗体的ELISA应运而生。

2.1 3 D非结构蛋白ELISA 3D非结构蛋白属于RNA聚合酶的核心成分，主要作用是蛋白裂解和蛋白折叠。在所有7种血清型中3D蛋白具有高度的保守性，因此理论上讲使用3D蛋白可以检测全部七种血清型病毒的感染。3D蛋白是第一种用于免疫动物群体中检测感染动物的非结构蛋白，过去3D蛋白来源于病毒培养物，但这样获得的蛋白在实际使用中可重复性不强，现在ELISA通常使用人工表达的方法获得3D蛋白。但也有研究表明，多次注射疫苗的动物体内也能够检测到3D抗体，这说明要从免疫动物中区分感染动物，在检测3D抗体的同时还应当检测其他非结构蛋白抗体以提高准确性。

2.2 3 B非结构蛋白ELISA 3B蛋白即通常所说的VPg蛋白，是一种病毒基因组绑定蛋白，它共价结合于基因组5’末端，作用是帮助病毒基因组做初步的折叠。另外VPg蛋白的拷贝数与宿主范围以及病毒毒力有关。国内最近报道了一种阻断ELISA［9］，此方法使用组氨酸单抗作为捕获抗体，3B单抗作为检测抗体，具有较为理想的检测效果。Gao等［10］设计了含有3B蛋白中三个B细胞线性表位的基因序列，并用大肠杆菌表达得到一种八聚体串联重复序列蛋白，以此蛋白建立间接ELISA，敏感性为96.8%，特异性为99%。

2.3 3 ABC非结构蛋白ELISA 3ABC蛋白在FMDV感染细胞裂解物中含量极低，并具有很强的免疫原性，所以理论上3ABC蛋白非常适合在ELISA中做抗原使用。有学者分别使用2C、3A、3B、3D和3ABC作为抗原，建立间接ELISA检测感染牛血清，结果标明3ABC间接ELISA效果最好［11］。过去绝大多数ELISA都是用大肠杆菌表达系统提供3ABC，为了使表达蛋白的构象接近自然蛋白，人们发明了杆状病毒表达系统。2003年Kweon等［12］开发了一种间接捕获ELISA，此法使用杆状病毒表达的3ABC蛋白以及3A单克隆抗体。由于抗原捕获可以起到净化蛋白的作用，Srisombundit等［13］用昆虫细胞表达了组氨酸标记的全长3C-3ABC蛋白，以此蛋白建立了单抗捕获间接ELISA，此法的特异性为96.6%，敏感性为84%。Clavijo等［14］建立了一种生物素化 3ABC竞争ELISA，此法可以广泛用于不同动物和不同血清型。还有其他多种检测3ABC抗体的间接，竞争或者阻断ELISA用于实践，事实证明这些方法都有良好的效果［15］。2007 年，Foord 等［16］提出了一种使用细菌表达系统的竞争ELISA，用噬菌体展示技术获得重组抗体的单链可变片段，同大肠杆菌表达的3ABC蛋白反应，这个实验揭示了单链抗体片段在ELISA中有代替单克隆抗体的可能。

3 ELISA在口蹄疫流行病学调查中的应用

临床上经常出现因流行毒株与制苗毒株之间亚种不同，使得疫苗免疫后保护率较差，因此有必要使用流行病学方法连续对田间流行毒株与制苗毒株的亲缘性进行比较，既可评价制苗种毒的效力，也可为选用合适的制苗种毒提供依据。

流行病学调查的重点在于区分对保护性免疫应答有意义的抗原表位，以及寻找在血清型及血清亚型之间变化的和保守的抗原表位。传统分析线性抗原表位方法都非常繁琐，1985年McCullough等报道了用液相ELISA鉴定FMDV抗原表位的方法，之后使用ELISA鉴别抗原位点的方法发展很快，各国的学者们使用单个或重复多肽位点的ELISA广泛分析VP1、VP2、VP3、VP4蛋白，并建立了抗原位点图。最近有文章［17-18］描述了使用重叠肽ELISA鉴别与感染有关的B细胞及T细胞抗原位点的方法。

由于单克隆抗体只针对某特定区域，现在大量的病毒都使用基于单克隆抗体的简单ELISA模式分析抗原表位，原理是毒株间不与单克隆抗体反应的毒株缺少与单抗对应的抗原表位。Aggarwal等［19］对牛、羊和猪注射O型FMDV血清亚型疫苗后，采血清用单克隆抗体研究不同抗原表位特异性，此实验使用竞争ELISA模式，研究发现VP1羧基末端在反刍动物是有效的抗原表位，但在猪却无法识别。从理论上讲多种单克隆抗体联合使用使得病毒至少有一个抗原表位被抗体辨认出，增加了ELISA在表位分析中的准确性，这将是以后ELISA研究的方向之一。

4 ELISA在病毒及蛋白定量中的应用

灭活疫苗的免疫原性主要来源于146S病毒完整颗粒，因此检测疫苗中病毒颗粒完整性非常重要。过去FMDV定量及完整性检测常用氯化铯或者蔗糖密度梯度离心法，此方法耗时耗力、需要昂贵的设备，并且不能判断获得的病毒是否已被蛋白酶水解。如果能制备针对146S构象表位的单克隆抗体，这种单抗只与完整病毒反应而不与蛋白亚单位反应，则使用这种单抗建立的ELISA不仅能够定量146S完整颗粒，而且能在不同疫苗生产模式下检测病毒颗粒完整性。Yang等［20］采用针对 O、A血清型的两种单克隆抗体建立了夹心ELISA，对FMDV完整病毒粒子进行定量，此法将检测146S抗原颗粒的精确性提升到了ng级别。

为验证灭活疫苗中的非结构蛋白含量是否超标，需要用疫苗多次免疫易感动物，然后检测血清中非结构蛋白抗体含量，这种方法费时费力，而且需要大量的实验动物，因此非常昂贵。Capozzo等［21］开发了一种过滤辅助化学分析 ELISA(FAL-ELISA)，能够直接对FMD灭活疫苗中的非结构蛋白进行定量，此方法检测纯化的非结构蛋白含量误差为2 ng，检测疫苗中非结构蛋白含量误差为4 ng，FAL-ELISA的特点在于省时且廉价。

5 总结与展望

通过比较近年来有关ELISA的报道，我们发现ELISA的研究趋势一是与单克隆抗体、RT-PCR等技术联合使诊断更加准确;二是简化操作步骤，增加自动化程度，使其更加方便快捷。在所有ELISA模式中，抗原捕获、阻断、竞争以及夹心ELISA有很高的特异性，而RT-PCR ELISA具有很高的敏感性;作为ELISA中重要的试剂，针对结构蛋白或非结构蛋白的单克隆抗体被大量制备，单克隆抗体既可作为捕获抗体也可做检测抗体，还可以与过氧化物酶结合使用;多种单克隆抗体结合以及单克隆抗体与血清多抗结合都是是比较好的抗体联合方式［22］。检测非结构蛋白抗体的ELISA可以从疫苗免疫动物群体中检测感染动物，但因为敏感性较低，仅检测一种非结构蛋白抗体的ELISA并不能准确分辨［23］，有鉴于此，国际上普遍认为可以通过同时检测多种非结构蛋白抗体来增加检测的准确性。有些ELISA在研发阶段检测效果非常好，但是经过规模化生产应用到实践当中检测效果却不理想，这涉及到生产工艺改进，血清稀释液研发等诸多问题，而此类研究的相关资料很少，将是今后ELISA研发的重要方向。

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