中药成分对新城疫强毒感染DF1能力的影响

刘 坤，邹海涛，李燕荣，李云岗，刘家国，姜 平，兰邹然

（1.南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；2.山东省动物疫病预防与控制中心，山东 济南 250022）

鸡新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的一种急性高度接触性传染病，发病率和病死率高，对养禽业危害大。到目前为止治疗病毒病还缺乏特效方法。接种疫苗是最普遍的预防措施，但是很难全面控制这类疫病。近年来，研究证实许多中草药以及其主要成分都具有抗病毒活性[1]，本试验测定了黄芩苷和氧化苦参碱等10种中药成分对新城疫强毒感染鸡胚成纤维细胞（DFI）能力的影响，为筛选出具有较强抗病毒作用的中药成分复方提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物和病毒 黄芩苷、三七总皂苷、氧化苦参碱、黄连小檗碱、菊花总黄酮、绿原酸、黄芪多糖、板蓝根多糖、板蓝根生物碱和淫羊藿多糖中药提取物，购自西安普莱特生物工程公司；NDV F48E8株，山东省家禽研究所惠赠。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM高糖细胞培养液；胎牛血清；MTT粉末；胰蛋白酶-EDTA；CO2培养箱；倒置显微镜；酶标仪；电子天平。

1.3 试验方法

1.3.1 将各中药成分用2%细胞维持液配制成含量为5 mg/mL的液体，过滤除菌，倍比稀释进行预试验测定药物的最大安全质量浓度[2]（氧化苦参碱、板蓝根生物碱、板蓝根多糖，2 500 μg/mL；金银花提取物、三七总皂苷，80 μg/mL；黄芪多糖，600 μg/mL；黄芩苷，150 μg/mL；黄连小檗碱，1 250 μg/mL；菊花总黄酮、淫羊藿多糖，300 μg/mL）。临用前将其作为最大浓度1，然后进行倍比稀释成2、3、4、5种浓度。

1.3.2 将病毒接种于单层鸡胚成纤维细胞（DF1），37℃5%CO2恒温培养，48 h收取细胞毒，按Reed-Muench法[3]测定TCID50，用细胞维持液配成100 TCID50浓度备用。

1.3.3.1 将已经长成致密单层的DF1用胰酶消化，将细胞数调整至5×105个/mL后加入到96孔细胞板中，每孔100 μL，37 ℃ 5%CO2条件下培养，待细胞长成单层后进行试验。试验组分别以3种方式[5]加入各质量浓度的中药成分和NDV，每种浓度的中药成分设4孔重复，同时设病毒与细胞对照组。（1）先加中药成分后接种NDV：每孔加入100 μL不同质量浓度的中药成分，培养2 h后弃掉孔内液体，再加入100 μL NDV；（2）先接种NDV后加中药成分：方法同上，顺序相反；（3）NDV和中药成分感作后同时加：4℃感作2 h后加入到DF1中，每孔100 μL。

1.3.4 细胞活性测定 37℃5%CO2培养箱中培养44 h后，每孔加入30 μL MTT溶液，放入培养箱继续培养4 h，倒掉孔内液体，加入100 μL DMSO，用微量振荡器震荡10 min后，用酶标仪测定OD570值作为衡量指标。

1.3.5 数据分析与处理 用SPSS软件对各组数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 先加中药后加病毒 从表1可以看出，黄芩苷在9.375～150 μg/mL，黄芪多糖在37.5～300 μg/mL，菊花总黄酮和淫羊藿多糖在18.75～300 μg/mL，氧化苦参碱在156.25～1250 μg/mL，三七总皂苷在5～40 μg/mL，板蓝根多糖和板蓝根生物碱在156.25～1250 μg/mL浓度范围内，均能抑制病毒感染细胞，而绿原酸和黄连小檗碱效果不明显。

表1 先加中药时10种中药成分的OD570值

2.2 先加病毒后加中药 从表2可以看出，黄芩苷在9.375～150 μg/mL，黄芪多糖在37.5～300 μg/mL，菊花总黄酮在18.75～300 μg/mL，氧化苦参碱在156.25～1 250 μg/mL，板蓝根多糖和板蓝根生物碱均在156.25～1 250 μg/mL，三七总皂苷在5～20 μg/mL，淫羊藿多糖在18.75 μg/mL，有抑制病毒的作用。而绿原酸和黄连小檗碱则无抗病毒效果。

2.3 中药和病毒感作后同时加入 从表3可以看出，黄芩苷在9.375～150 μg/mL，菊花总黄酮在18.75～300 μg/mL，氧化苦参碱在156.25～2 500 μg/mL，三七总皂苷在5～40 μg/mL，黄芪多糖在37.5～300 μg/mL，板蓝根多糖和板蓝根生物碱在156.25～1 250 μg/mL，黄连小檗碱在156.25～312.5 μg/mL，淫羊藿多糖在37.5 μg/mL能够抑制病毒感染细胞，而绿原酸无效果。

3 讨论

近年来，很多研究已经证实，许多中草药以及其成分具有抗病毒活性，并用于抗病毒和细菌感染[5]。本试验通过三种不同方式将NDV和中药成分加入到DF1中，充分作用后用MTT法测定细胞的OD570值作为中药对病毒抑制作用的衡量指标。当试验组的OD值显著高于病毒对照组时，表明药物在适当的浓度范围内能够抑制病毒的感染。从试验结果可以看出，黄芩苷、三七总皂苷、黄芪多糖、板蓝根多糖、板蓝根生物碱、氧化苦参碱、菊花总黄酮这7种药物无论哪种加药方式，均能够对病毒产生抑制作用，淫羊藿多糖在先于病毒加入时效果明显，绿原酸在与病毒感作后有较弱的抗病毒效果，而黄连小檗碱对NDV不产生抑制效果。此次试验的结果与邢玉娟[6]等人研究相似。但试验中中药的最大安全浓度以及OD值与先前报道的数值[3]有些不同，或许与中药成分的质量以及细胞不同有关。

从给药方式来看，总体上，先加中药后加病毒对抑制病毒感染的能力较其他两种方式要强。不同药物浓度对抑制病毒的能力也有一定影响，如黄芩苷和菊花总黄酮在高浓度时对病毒的抑制效果要强于低浓度时，而三七总皂苷和氧化苦参碱这两种中药成分则在较低浓度时对病毒的抑制作用较强。因此，在选取中药要同时考虑以上两因素，才能发挥中药的最佳抗病毒效果。

表2 先加病毒时10种中药成分的OD570值

表3 中药病毒感作后10种中药成分的OD570值

在治疗病毒病方面，一些细胞因子虽然能够抑制病毒复制，但是由于成本高，所以仍然停留在实验室研究或者临床试验阶段。此外，虽然还有一些化学合成的抗病毒药物在临床上使用，但其临床效果也不尽人意，并存在药物残留等不利因素。鉴于目前我国对病毒病防治存在一定困难，中药在治疗病毒病方面的应用具有不错的前景。通过此次试验，筛选出抗病毒效果较好的单药成分，为组成中药组方，发挥协同效应，使中药达到抑制病毒的最佳效果奠定了坚实的基础。

[1]Ji Y B.Chemistry and Pharmacology of Chinese Herbal Medicine Compound People’s Health Press[J].Beijing，2003，Suppl.pp.18-35.

[2]刘家国，陈玉库，胡元亮，等.几种天然药物成分在体外CEF中最大安全浓度的测定[J].动物医学进展，2002，23（3）：88-91.

[3]殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997：204-246.

[4]李德胜，胡元亮，索珍，等.12种藏药对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响[J].中国兽医学报，2008，28（9）：1061-1064.

[5]Schnitzler P，Schuhmacher A，Reichling J.Virucidal effect of peppermint oil on the enveloped viruses herpes simplex virus type 1 and type 2 in vitro[J].Phytomedicine，2003，504-510.

[6]邢玉娟，陈玉库，胡元亮，等.7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响[J].中国兽医杂志，2011，47（9）:46-48.