RT-LAMP检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

鲜思美，杨 钰，汪德生，刘 嫒，尹强军，邓 诗，苏 刚，孔维祥

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025）

鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由冠状病毒科（Coronavriridge）冠状病毒属（Coronavirus)的传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统，已发现呼吸型、肾型、肠型等多种致病型[1-3]。IBV为正链单股RNA，全长约为17 kb。病毒囊膜有花冠状排列的纤突，长约20 nm，病毒粒子略呈球形，直径约为120 nm。IBV主要含有3种特异性结构蛋白：表面纤突糖蛋白（S）、整合在双层膜中的膜蛋白（M）和与RNA相结合的核衣壳蛋白（N）[4]。IBV基因组很容易发生变异，导致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等易发生变化，给本病的预防、诊断和控制带来很大困难。目前，检测IBV的分子生物学方法有RT-PCR、核酸探针、实时荧光定量PCR和RT-LAMP技术等[5-8]。为了能够准确、快速地诊断该病，提高分子生物学方法检测IBV的敏感性，本试验建立了RT-LAMP诊断方法，以为鸡传染性支气管炎的临床诊断和病原学调查提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 病毒及病料 IBV、禽流感病毒（AIV）、传染性囊病病毒（IBDV）、马立克病病毒（MDV）及新城疫病毒（NDV）和6份传染性支气管炎病毒病临床疑似病料均由贵州省动物疫病研究室保存。

1.2 主要试剂 Thermopol Buffer、Bst DNA聚合酶，购自北京纽英伦（NEB）生物技术有限公司；M-MLV反转录酶（200 U/μL），购自上海丽臣生物科技有限公司；RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物设计与合成 参照GenBank中登录的IBV N基因序列（NC001451），应用在线Primer Explorer 3.0软件设计了4条引物，包括两条外引物F3/B3，两条内引物FIP/BIP。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

IBV-F3：CTACGATTCTCGGATGGC；

IBV-B3：TGCACGAGCAATAAGGTC；

IBV-FIP：TGTTGATCTTCCACTCCTACCACTTT TCCTGATGGTAATTTCCGTTG；

IBV-BIP：CAGCTTCATCAGCAGCAGCTTTTTA TCTCCAGAATCACTTCTACG。

1.4 病毒与病料RNA提取 参照RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒说明书，提取IBV、AIV、IBDV、MDV、NDV和6份临床疑似IB病料的RNA。

1.5 RT-LAMP反应体系的优化 病毒RNA的反转录和LAMP反应体系的优化参照文献[9]进行，采用25 μL反应体系，分别对内、外引物浓度、Bst DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、反应温度及反应时间等进行优化，以确定LAMP最佳反应体系。

1.6 特异性试验 将NDV、AIV、MDV、IBDV进行RT-LAMP检测，检验其特异性。

1.7 敏感性试验 以IBV RNA反转录cDNA为模板，用TU-1810测定其纯度和浓度，10倍递进稀释，进行RT-LAMP，测定该方法的敏感性。同时用建立的RT-LAMP和常规RT-PCR进行检测，RT-PCR采用LAMP外引物进行扩增，比较RTLAMP与常规RT-PCR检测的灵敏度。

1.8 临床样本检测 采用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对6份临床病料进行检测，以比较这两种方法的检出符合率。

1.9 RT-LAMP反应结果的可视化判定 RT-LAMP反应完成后，扩增产物7 500 r/min离心5 min，然后将离心管置于光亮处观察有无白色沉淀生成，观察可视化结果。

2 结果

2.1 LAMP反应体系的优化结果 通过对内、外引物浓度、Bst DNA聚合酶、dNTP、Mg2+等进行优化试验，确定最佳内引物与外引物的浓度比为40 μmol/L:5 μmol/L（图 1），Bst DNA 聚合酶（8 U/μL)1.0 μL（图 2），dNTP（10 mmol/L）3.0 μL（图 3），镁离子浓度为25 mmol/L 3.0 μL（图4）。

确定的最佳反应体系为：FIP&BIP（20 μmoL/L）2.0 μL，F3&B3（5 μmoL/L）1.0 μL，Bst DNA 聚合酶（8 U/μL)1.0 μL，dNTP（10 mmoL/L）3.0 μL，MgCl2（25 mmoL/L）3.0 μL，最后加灭菌去离子水补足25 μL。

2.2 LAMP反应温度和反应时间的优化结果 通过对LAMP反应温度和反应时间进行优化试验，确定最佳反应温度为62℃（图5），最佳反应时间为 60 min（图 6）。

2.3 特异性试验 以优化的RT-LAMP方法对IBV、AIV、IBDV、MDV、NDV的cDNA进行扩增，结果只有IBV出现了特征性梯状条带，而其他模板未见扩增条带（图7）。

2.4 敏感性试验 建立的RT-LAMP方法最低检测到10-6稀释模板，即为0.19 pg cDNA模板（图8）。而常规RT-PCR方法能检测到cDNA的最低稀释度10-3（图9），结果显示，本试验建立的IBV RT-LAMP敏感性比常规RT-PCR高1 000倍。

2.5 RT-LAMP方法对临床样本的检测 应用建立的RT-LAMP方法对6份临床病料进行检测，结果（见图10），IBV检出率为100%（6/6），与RT-PCR的检出结果相符，二者的检出符合率为100%。

2.6 RT-LAMP反应结果的可视化判定 LAMP反应完成后，产物7 500 r/min离心5 min，然后将离心管置于光亮处观察有无白色沉淀生成。其结果如图11所示。

图11中，1号管为阳性组，肉眼可看到明显的白色沉淀，2号管为阴性组，未见到沉淀。因而可以直接观察反应是否发生。

3 讨论

LAMP技术反应特异性主要依靠外引物(F3、B3)和内引物(FIP、BIP)的扩增来实现[10]。本试验根据IBV结构蛋白N基因保守序列，采用在线Primer Explorer 3.0软件设计了4条引物，所设计的引物能特异识别目标序列的6个区域，特异性扩增IBV的靶基因，通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为大小不同的梯状条带，而AIV、IBDV、MDV、NDV未见扩增条带，表明该方法的特异性强。本试验建立的RT-LAMP方法敏感性比常规RT-PCR高1 000倍，两种方法对临床样本检测的符合率为100%，表明建立的方法敏感性高，可用于临床上IBV的分子生物学检测。

LAMP方法的建立可在复合引物F1C和F2间及B1C和B2间设计环引物F-loop和B-loop，目的是提高反应效率，减少试验耗时。本试验为减少加样次数，简化试验操作过程，在不加环引物的反应体系中，从15 min开始有条带，并且逐渐变亮，可在60 min内完成全部反应，为IBV感染的快速检测提供新方法。

LAMP扩增产物的检测主要有3种，凝胶电泳检测，浊度检测和荧光显色。通过凝胶电泳检测可见特异性的梯状条带；反应完成后可直接通过观察扩增副产物白色焦磷酸镁沉淀混合液判定反应结果；也可在反应体系中加入钙黄绿素(Calcein)和Mn2+、羟基萘芬蓝（HNB）、Picogreen、溴化乙锭（EB），或向产物管中加入SYBR Green I、Gene Finder染料显色[11-12]。本试验在反应结束后，在LAMP反应不开盖的前提下，直接离心，目视检查LAMP的副产物焦磷酸镁悬浊液形成白色沉淀，阳性反应管白色沉淀集于管底，阴性反应管无此现象。由此可见LAMP反应结果易于判定，适合于基层兽医站和养殖场进行快速检测。

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