一株猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析

王伟丞，梁海英，曾智勇，汤德元，刘 钊

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学教学实验场，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PMWS于1997年首次在加拿大报道，随后在美国、法国、德国、日本等多个国家相继报道。近年来该病在我国普遍流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1]。2000年郎洪武等首次报道中国猪群存在PCV2感染，阳性率为42.9%[2]。2007年周绪斌等报道在2000-2005年间20多个省市PCV2感染平均阳性率达55.04%[3]。根据崔亚兰等对贵州省2007-2011年猪圆环病毒感染的流行病学调查结果表明，PCV2在贵州省的感染日益严重[4]；另根据本实验室对2011-2012年间贵州部分地区的PCV2血清学调查发现，PCV2野毒感染的阳性率高达61.3%[5]。如今PCV2及其所致的相关疾病越发严重，已成为研究的热点。

2013年12月上旬，贵州省开阳县某猪场10日龄左右的仔猪发生体温升高、下痢、皮肤发红、极度消瘦为特征的急性传染病，并导致仔猪大量死亡，12月中旬该猪场送检1头病死仔猪以确定病原感染类型，经猪繁殖障碍性病毒性疫病6重PCR检测方法[6]诊断为PCV2和PRRSV混合感染。为了解该毒株的分子遗传背景，试验针对PCV2全基因设计了1对特异性引物，对该毒株进行全基因组的扩增、克隆和序列分析，旨在给贵州省PCV2的流行病学研究、诊断与防控、疫苗免疫等提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 病料样品系贵州省开阳县某猪场送检的疑似PMWS的1头病死仔猪。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ、DL-2 000、pMD19-T Simple Vector，购自宝生物工程（大连）有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit，OMEGA公司产品；普通质粒小提试剂盒为TIANGEN公司产品；大肠杆菌感受态TOP10（贵州省动物疫病研究室制备和保存）；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank上已发表的PCV2序列设计1对引物扩增全序列：

PCV2-S：5′-CCCAAGCTTCTTTTTTATCACTTC GTAATGGTTTT-3′；

PCV2-As：5′-GGTGGATCCACTCAGTAATTTA TTTCATATGGA-3′。

分别在引物两端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点（划线部分），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 病毒DNA的提取 取送检病死仔猪淋巴结、肾脏、脾脏等组织用PBS按1∶5倍稀释研磨，制成乳悬液，-80℃反复冻融3次后，8 000 r/min离心15 min，取上清按照DNA提取试剂盒操作步骤提取病毒核酸，-20℃保存备用。

1.5 PCV2全基因组的克隆与测序 利用设计的PCR引物，以上述制备好的DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：模版DNA 5.0 μL，10×LA Taq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 8.0 μL，上下游引物各1μL，LA Taq 0.5 μL，ddH2O 29.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94℃热变性1 min，57℃退火40 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将3个目的基因片段按照常规方法分别克隆到pMD19-T Simple载体中，进行PCR、酶切和测序鉴定。

1.6 序列分析 应用DNAStar 7.0和MEGA5.0生物学软件对克隆的PCV2全基因组序列与Gen-Bank中查得的PCV2全基因组核苷酸序列进行比对分析。

2 结果

2.1 病料PCR的扩增 以组织中提取的病料核酸为模版，应用上述特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，扩增出1条与预期片段大小1 800 bp左右的特异性条带（图1）。

2.2 重组质粒的鉴定 将纯化的PCR产物连接至pMD19-T Simple载体，重组质粒pMD19-TPCV2经PCR和双酶切鉴定，均获得大小约1 800 bp的与预期片段大小一致的DNA片段，与预期结果相符（图2）。

2.3 序列分析 测序结果表明，该毒株基因组全长为1 767 bp，GenBank登录号为KJ139962，将其命名为GZ-KY1株。与从GenBank收录的毒株序列中选取的20株不同国家和地区的PCV2毒株进行核苷酸序列相似性比对分析，结果表明，所有PCV2毒株之间的序列相似性均相对较高，介于94.1%～98.4%之间，其中GZ-KY1与GQ359008(上海)的毒株的相似性最高为98.4%，与EU148504（丹麦）毒株相似性最低分别为94.1%，与疫苗株LG(HM038034)和SH(AY686763)的相似性分别为95.0%和96.3%。

为了更好地了解PCV毒株的遗传学特性及相互间亲缘关系，应用MEGA5.0软件，以相关PCV2毒株全基因组核苷酸序列，绘制了系统发生进化树（图3）。根据2008年欧盟猪圆环病毒疾病委员会基因分型的标准[7]，可将PCV2 KJ139962-GZKY1（开阳）株划归为PCV2b基因型，且贵州株JQ809463-GZ-QZ1（清镇）和JQ809464-GZ-RH1（仁怀）均属于PCV2b基因型，仅JQ809462-GZCS1（长顺）株属于PCV2a基因型，表明贵州地区流行的PCV2基因型以2b型为主。

3 讨论

PCV2相关疾病已成为危害我国养猪业的重要疫病，其单独感染较少，常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒等混合感染，表现出严重的临床症状和较高的死亡率。PCV2主要分为PCV2a，PCV2b，PCV2c三个亚型，其中PCV2a主要在欧美等国家和亚洲的日本、韩国、中国台湾等；PCV2b包含了加拿大、美国、巴西、中国等；PCV2c仅在丹麦有报道。有学者认为PCV2的不同基因型毒力不同，普遍认为PCV2b的致病力要强于PCV2a，且在1998-2002年间我国流行的猪圆环病毒主要以PCV2a亚型为主，2002年以后PCV2a亚型较少，主要以PCV2b为主[8]。

本试验从贵州开阳地区疑似PMWS病料中通过PCR扩增获得了一株PCV2全基因序列。经序列分析表明，该毒株属于PCV2b亚型，且本实验室先前分离的3株PCV2毒株中，2株PCV2b亚型，1株为PCV2a亚型，表明贵州地区流行的猪圆环病毒也以PCV2b为主。与国内外参考毒株之间的相似性在94.1%～98.4%之间，表明所有PCV2毒株之间的亲缘关系均较近，基因组比较保守，但近年来我国也有PCV2基因组大小为1 766 bp的报道，这可能是PCV2变异所致[9-10]，这些变异是否和毒力以及临床症状有关有待进一步研究。

目前PCV2已经在我国猪场广泛存在，猪场对于PCV2的防控除加强饲养管理外，还需要对混合感染的其他病原作适当的主动免疫和被动免疫，预防性给药治疗控制细菌性疾病的混合感染或继发感染，同时开展有效的综合性防制措施，才能起到事半功倍的效果[11]。

[1]Li W，Wang X，Ma T，et al.Genetic analysis of porcine circovirus type 2(PCV2)strains isolated between 2001 and 2009：genotype PCV2b predominate in postweaning multisystemic wasting syndrome occurrences in eastern China[J].Virus Genes，2010，40（2）:244-251.

[2]郎洪武，张广川，吴发权，等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技，2000，30（03）:3-5.

[3]周绪斌，张馨玉，许秀梅.我国猪圆环病毒2型的流行情况和分析[J].中国猪业，2007（05）:37-41.

[4]崔亚兰，王开功，张华，等.2007-2011年贵州省猪圆环病毒感染的流行病学调查[J].畜牧与兽医，2013，45（03）:70-73.

[5]王伟丞，曾智勇，刘志杰.贵州省几种猪繁殖障碍性疫病抗体水平检测[J].贵州农业科学，2013，41（05）:118-120.

[6]刘志杰，曾智勇，汤德元，等.猪繁殖障碍病毒性疫病六重PCR检测方法的建立及应用[J].畜牧兽医学报，2012，43（09）:1429-1436.

[7]Cortey M，Olvera A，Grau-Roma L，et al.Further comments on porcine circovirus type 2（PCV2）genotype definition and nomenclature[J].Vet Microbiol，2011，149:522-523.

[8]黄新，康立超，韩猛立，等.猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析[J].中国兽医科学，2012，42（5）:461-466.

[9]郭龙军，陆月华，危艳武，等.我国部分地区猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析[J].中国预防兽医学报，2009，31（11）:856-859.

[10]Shang S B，Jin Y L，Jiang X T，et al.Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2[J].Mol Immunol，2009，46（3）:327-334.

[11]贾怀杰，王晓霞，房永祥，等.猪圆环病毒2型甘肃株全基因组克隆及序列分析[J].动物医学进展，2010，37（1）:1-6.