MicroRNA let-7e与食管鳞癌临床分期研究*

许一鸣，仲崇俊，田 婷，肖 平

（南通大学第二附属医院心胸外科,江苏226001）

食管癌是食管上皮组织常见恶性肿瘤，其发病率在恶性肿瘤中居第8位，病死率居第6位。全世界每年有48万新增病例[1]，而我国是世界上食管癌发病率和病死率最高的国家。食管癌的预后较差，总的5年生存率只有8%～30%。食管鳞状细胞癌是中国食管癌主要病理类型[2]。近年来随着微小RNA的发现，微小RNA与人类食管癌发生、发展的关系成为新的热点。我院2012年7月—2013年12月住院手术治疗并经病理明确诊断食管癌患者60例，我们在前期研究中证实，let-7e在食管癌组织中表达水平高于癌旁组织，本课题将进一步阐述let-7e与食管鳞癌临床分期的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 食管癌患者60例，男36例，女24例，年龄 42～76 岁，平均 62.2±6.07 岁。鳞癌 32 例，腺癌28例；发生淋巴转移者34例，未发生转移26例；根据第7版TNM系统进行临床分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期23例，Ⅲ期16例。所有患者均未接受放化疗。本项研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）组织标本收集与处理：患者肿瘤组织标本及其对应的癌旁组织（离癌组织＞1cm）样本手术后30分钟内液氮冷冻后保存于-70℃冰箱待检。（2）仪器和试剂：荧光PCR引物及探针使用Primer Express软件(AB)设计，试剂采用是 AB（美国）公司的 TaqManMicroRNA Assays、TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqManUniversal PCR Master Mix等试剂试剂盒，MicroRNAlet-7e TaqManMGB引物及探针由AB公司合成。（3）RNA提取：癌组织及癌旁组织总RNA分离采用mirVana miRNA Isolation Kit(AB)；（4）逆转录反应：7.00μL总反应体系轻轻混匀，稍微离心，用前置于冰上。每个样品取5.0μL RNA与7.0μl RT-MIX混合，然后加入3.0μL 5×RT PRIMER，轻轻混匀。按照16℃30min,42℃ 30min,85℃,5min,4℃条件进行反转录。（5）荧光定量PCR：以看家基因U6 snRNA做为内参，反应体系为 20μL(1.33μL RT product,1.0μL of 20×TaqMan miRNA Assay Mix,10.0μL of 2×Taq-Man PCR Master Mix,and 7.67μL nuclease-free water),使用基于分析系统软件sds2.3的实时定量PCR仪ABI7900 HT，对癌组织及癌旁组织进行内参基因及目标基因MicroRNAlet-7e按照95℃ 10 min预变性，95℃ 15s，60℃ 60s荧光检测1次，共40个循环进行 PCR扩增，得到相应Ct值。（6）癌组织及癌旁组织分别同时进行内基因基因U6 snRNA及MicroRNAlet-7e扩增,分别q–PCR3次，得出Ct值均值，以癌旁组织为对照，应用ΔΔCt法计算癌组织对比癌旁组织MicroRNAlet-7e表达相差倍数，得出为正值，即癌组织表达水平比癌旁组织表达水平高。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量指标采用±s表示，One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test计算结果分析数据符合正态分布，应用t检验分析MicroRNAlet-7e表达差异与不同临床分期的关系，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MicroRNA let-7e在食管癌组织及相应癌旁组织中的表达 以癌旁组织为对照，以看家基因U6 snRNA为内参，应用ΔΔCt计算出癌组织MicroRNA let-7e的表达水平比癌旁组织高，差异有统计学意义（t=3.3183，P＜0.05），可信区间 95%。见表 1、图 1。2.2 MicroRNA let-7e含量与食管癌组织病理特征的相关性 MicroRNA let-7e表达水平与患者性别、组织学类型、淋巴转移、分化程度、分期差异无统计学意义（P＞0.05），I期与 III期相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

表1 MicroRNA let-7e在食管癌组织及相应癌旁组织中的表达（±s）

表1 MicroRNA let-7e在食管癌组织及相应癌旁组织中的表达（±s）

组别例数Ct（let）Ct（U6）ΔΔCt癌旁组织 60 24.78±1.08 13.14±0.56 11.64±1.02癌组织 60 26.55±0.97 14.21±0.87 12.34±0.86

图1 癌组织与癌旁组织MicroRNAlet7e表达倍数图表

表2 MicroRNA let-7e含量与食管癌组织病理特征的相关性（例，±s）

表2 MicroRNA let-7e含量与食管癌组织病理特征的相关性（例，±s）

a：高分化组与中分化组相比；b：中分化组与低分化组相比较；c：高分化组与低分化组相比；d：I期与II期相比；e：II期与 III期相比；f：I期与 III期相比。*P＜0.05。

病理特征 分类 例数 ΔΔCt t P性别 男 36 11.306±6.261 0.799 0.381女 24 8.807±5.945组织学类型 鳞癌 32 11.283±6.475 0.498 0.488腺癌 28 11.399±6.083淋巴转移 有 34 9.121±5.531 2.224 0.032*无 26 13.545±6.816分化程度 高分化 9 14.833±6.500 0.201a 0.842中分化 19 14.283±6.857 2.192b 0.037*低分化 32 9.165±5.366 2.189c 0.041*病理分期 Ⅰ 21 13.011±5.430 0.750d 0.461Ⅱ 23 14.912±6.752 3.015e 0.006*Ⅲ 16 8.010±5.585 2.312f 0.029*

3 讨 论

人类MicroRNAs let-7家族由13个成员组成[3]，MicroRNAlet-7家族是由Reinhart等首次在秀丽隐杆线虫(Celegans)发育后期发现,是线虫时序性发育的关键性调控因子。在Celegans中，长约21nt，从具有茎环折叠结构、70个核苷酸前体分子发展而来的，参与细胞形态发生及表达。Let-7e不同于家族中其他成员，作为一种具有抑癌作用的微小RNA，成为目前肿瘤研究热点。

我们首次应用实时荧光定量RT-PCR Taqman MGB探针法，检测MicroRNA let-7e在食管鳞癌60例癌组织及癌旁组织中表达水平的差异。研究发现，MicroRNA let-7e在食管癌癌组织表达水平明显高于癌旁组织，且在不同临床分期差异有统计学意义（P＜0.01）。进一步证实其在食管癌癌组织中，MicroRNA let-7e的表达水平明显高于癌旁组织表达，认为MicroRNA let-7e可以作为临床食管鳞癌临床分期的分子生物学标记。

研究发现，在食管癌组织与正常食管粘膜组织存在大量差异表达的基因，这些基因与细胞增殖分化凋亡的调节密切相关。miRNA分子是一类长18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，在转录后水平调控基因表达。即通过阻遏局部互补的mRNA的碱基配对的翻译，从而抑制基因的表达，它是公认的抑制基因表达生物过程中的关键调节器[4]。文献报道在食管鳞癌中，表达异常的微小RNA包括miR-143、miR-145、miR-21、miR-27a、miR-375 等[5-6]，而 let-7e在食管癌中相关报道不多。本研究发现，microRNA let-7e在癌组织的表达水平比癌旁组织高，且临床分期越高，其增高程度越明显。不同临床分期的microRNA let-7e表达差异有统计学意义，说明microRNA let-7e可作为判断食管鳞癌预后的指标。Shell等[7]发现，let-7e的靶基因HMGA2是一个较理想的预测预后的标志物。其表达水平联合let-7e对患者预后的评价效果优于传统标志物，可作为癌症的诊断指标；Larsen[8]利用基因表达分析技术证实鳞癌生存期的长短与基因表达结果平行。Chen等[9]报道miRNA调节食管鳞癌细胞的转移和侵袭能力，淋巴结转移患者的miRNA表达显著升高，miRNA高表达的患者预后较差。Ogawa R等[10]报道，miR-129的高表达造成的早期病死率为低表达者18.11倍，表明miRNA的高表达对食管鳞癌的预后起着重要作用。Hong等[11]研究结果显示，miRNA低表达与食管癌患者较长的生存期相关。

MiRNA let-7e在食管鳞癌发生、发展和预后中有非常重要的作用。但在食管癌诊断和治疗中的研究还有所欠缺，而且其标本来源主要是患者的癌变组织，由于这一来源有限且提取步骤繁琐，间接影响到结果的准确性[12]。而在肿瘤患者的血液或尿液中存在着相对特异的miRNA表达谱，且稳定性强，重复性好。可将其作为肿瘤早期诊断、个性化治疗、预后监测或跟踪随访的非创伤性生物标志物[13]。此外，在食管癌的高发地区，如中国、日本和亚洲其他国家的食管癌高发地区，以鳞型细胞癌多见，而在欧美国家食管癌低发地区则以腺癌为主。不同组织类型的食管癌与miRNA let-7e的影响有多大尚不清楚，还需要进一步研究。

综上所述，在食管鳞癌中，miRNA let-7e通过调节不同的下游靶基因的表达参与了肿瘤的发生。miRNA let-7e的发现和深入研究对于食管鳞癌有着重要的临床意义：具有高危险基因表达的食管鳞癌患者，可以从辅助化疗中获益，而低危险基因表达的患者可以省去不必要的治疗。

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