雷公藤多苷通过PI3K/AKT信号通路影响大鼠卵泡发育的实验研究＊

蔡 竞 吴克明 黄 丽 熊婷婷 廖凤娇 陕西中医学院附属医院妇科（咸阳712000）

△成都中医药大学临床医学院（成都610075）

卵泡发育障碍是指卵泡发育、成熟和排出障碍，主要表现为卵巢功能低下，是临床上引起月经量少、月经稀发、闭经、不孕、甚至卵巢功能早衰等疾病的主要原因，其临床发病率居高不下，严重影响了妇女的生殖和心理健康。

雷公藤多苷是目前临床上使用较多的非甾体类免疫抑制剂，其对女性生殖系统的影响主要表现为月经紊乱和闭经。因此有许多研究者利用其生殖毒性成功建造了卵巢功能低下的动物模型，并利用该动物模型大量深入的研究了卵巢功能低下类疾病的病理机制。

PI3K/AKT信号通路广泛存在于细胞中，是参与细胞生长、增殖和分化调节的信号通路。近年来，许多学者利用基因突变动物模型进行研究，发现此信号通路在哺乳动物始基卵泡激活、卵泡生长及其排卵过程中均起着非常重要的作用。雷公藤多苷抑制卵泡发育是否与该信号通路有关，目前尚未见报道，本实验研究拟以PI3K/AKT信号通路为切入点研究雷公藤多苷抑制卵泡发育的分子机制，为临床防治雷公藤多苷雌性生殖毒性提供客观依据。

1 材料与方法1.1 实验动物及分组处理 雌性成年SD大鼠，清洁级，7～8周龄，健康，体重200～220g，自由饮水摄食，室温控制在22℃～25℃，湿度为70%，连续5～10d行阴道脱落细胞涂片，并伊红染色，光学显微镜下观察阴道脱落细胞变化，选出连续2次情动周期为4～5d的大鼠18只纳入实验。将18只大鼠按区组随机法分为模型组和对照组，每组9只，两组动物体重比较无显著性差异。模型组大鼠每日灌服雷公藤多苷40mg/kg，对照组大鼠灌服等剂量的蒸馏水，灌胃第8周始行阴道脱落细胞检查观察大鼠性周期变化，当模型组所有大鼠出现动情周期延长甚至紊乱时，确定造模成功。称重、采血后处死大鼠，摘取双侧卵巢，称重，一侧卵巢置入液氮罐中保存备检，另一侧卵巢置入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2 试剂及耗材 雷公藤多苷片由湖南协力药业有限公司生产；E2、P放免试剂盒购于天津九鼎医学生物工程有限公司；FSH、LH ELISA试剂盒由成都天合利科技有限公司提供美国Rapid BioLab.公司产品；兔抗鼠p－AKT（Ser473）多克隆抗体、兔抗鼠p－mTOR（Ser2448）多克隆抗体、兔抗鼠p－p70S6K（Ser 389）多克隆抗体均购自美国Cell Signailing Technology公司，相应的二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 检测指标 1.3.1 一般情况：包括精神状态、进食、活动情况以及大小二便情况，每周测量大鼠体重，根据体重调整用药剂量。

1.3.2 动情周期：造模后第8周起每日早晨8点行阴道脱落细胞涂片，固定后行伊红染色，光学显微镜下观察阴道脱落细胞形态，以确定大鼠动情周期变化。

1.3.3 性激素水平：最后一次给药24h后，股动脉取血，常规分离出血清，采用酶联免疫吸附法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测血FSH和LH水平；采用γ放射免疫分析法（radio immune assay，RIA）测定血清E2、P的含量。

1.3.4 卵巢指数：最后一次给药24h后，股动脉取血后处死动物，剖腹小心取出完整卵巢（双侧），去掉筋膜与脂肪组织，电子天平称重，按以下公式计算得出卵巢指数［1］：

卵巢指数＝卵巢湿重（mg）/体重（g）×100%

1.3.5 卵巢组织形态学：取出一侧卵巢，置于4%多聚甲醛溶液中固定，充分固定24h后进行脱水，卵巢组织切片，常规HE染色，光学显微镜下观察。

1.3.6 各级卵泡计数：HE染色的大鼠卵巢组织切片于20倍光学显微镜下观察，计数每张切片上各级卵泡、闭锁卵泡的数目。各级卵泡的分类参照 Myers［2］等的分类方法：①原始卵泡：包括始基卵泡和初级卵泡，始基卵泡由一个中央的卵母细胞和单层扁平的颗粒细胞组成，初级卵泡由中央的卵母细胞和其周围单层的立方状颗粒细胞组成，或者单层的颗粒细胞中至少有3个立方的上皮细胞。②次级卵泡（或者称为窦前卵泡）：卵泡包含2层或者2层以上的颗粒细胞，没有形成窦腔。③窦状卵泡：卵泡中包含2层或者2层以上的颗粒细胞，有窦腔形成。④闭锁卵泡：卵泡壁凹陷，卵母细胞形态不规则，细胞核固缩或溶解；颗粒细胞及卵泡膜细胞松散、萎缩并脱落进入卵泡腔；透明带塌陷。为避免重复计数，原始卵泡以卵母细胞核作为标记物计数；次级卵泡和窦状卵泡以卵母细胞核仁为标记物计数。

计算方法：各级卵泡计数：以每个卵巢切面上不同发育阶段卵泡各占整个卵巢切面上总卵母细胞数的百分比表示各级卵泡的数目。

1.3.7 Western－blotting法检测卵巢 组织中 p－AKT、pmTOR、p－p70S6K含量：大鼠的另一侧卵巢置入液氮中备检，常规方法提取卵巢组织总蛋白，进行SDS－PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，用TBST稀释的5%的脱脂奶粉室温（18℃）封闭 PVDF膜1h，分别加入相应的一抗（p－AKT、pmTOR、p－p70S6K、β－ACTIN，浓度均为 1：1000），4℃ 过夜；TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗（用含5%脱脂奶粉的PBST 1：2 000稀释），37℃1h；最后用化学发光显示目的条带，quantity one分析软件分析蛋白灰度值，目的蛋白的相对表达量＝目的蛋白灰度值/内参灰度值。

2 结 果2.1 一般情况 在造模最初的1～2周内，模型大鼠体重增加不明显，少数大鼠体重减轻，2周后大鼠体重逐渐增加，但增加较对照组缓慢。在造模过程中，模型组大鼠逐渐出现反应较迟钝，精神萎靡，活动减少，体毛暗淡无光泽，大便量多且偏稀，竖毛，蜷缩拱背，畏寒肢冷，喜扎堆等。造模10周后，模型组大鼠体重较对照组明显下降（P＜0.01，见表1）。

表1 两组大鼠体重的比较（±s）

表1 两组大鼠体重的比较（±s）

注：与对照组比较：▲▲P＜0.01。

组别 动物（只）体重（g）9 255.59±14.24模型组 9 235.22±13.85对照组▲▲

2.2 动情周期变化 大鼠正常的动情周期为4～5d，应用雷公藤多苷造模10周后，模型组大鼠动情周期延长甚至紊乱，表现为动情周期大于7d，持续的动情间期，无动情前期及动情期，个别大鼠表现为持续的动情期。与对照组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.01，见表2）。

表2 新两组大鼠动情周期的比较（±s）

表2 新两组大鼠动情周期的比较（±s）

注：与对照组比较：▲▲P＜0.01。

组别 动物（只）动情周期对照组9 4.889±0.782模型组 9 8.778±1.394▲▲

2.3 性激素水平变化 见表3。

表3 两组大鼠性激素水平的比较（±s）

表3 两组大鼠性激素水平的比较（±s）

注：与对照组比较：▲▲P＜0.01。

组别 动物（只）E2（pg/mL）P（ng/mL）FSH（mIU/mL）LH（mIU/mL）对照组 9 107.97±27.01 12.88±4.31 1.006±0.074 0.987±0.295模型组 9 19.93±9.46▲▲ 6.01±1.63▲▲1.029±0.082 0.948±0.107

2.4 卵巢湿重及卵巢指数变化 见表4。

表4 两组大鼠卵巢湿重和卵巢指数的比较（±s）

表4 两组大鼠卵巢湿重和卵巢指数的比较（±s）

注：与对照组比较：▲▲P＜0.01。

组别 动物（只）卵巢湿重（mg）卵巢指数（%）9 93.61±16.40 0.365±0.056模型组 9 66.67±6.72▲▲ 0.285±0.037对照组▲▲

2.5 卵巢组织形态学变化 卵巢组织切片HE染色结果示：对照组大鼠卵巢可见始基卵泡，各级卵泡生长活跃，卵泡体积较大，卵泡液多，颗粒细胞层较厚，闭锁卵泡数目较少，黄体发育良好，数目较多。模型组大鼠生长卵泡数目减少，卵泡体积减小，颗粒细胞层较薄，黄体数目少，闭锁卵泡数目多，卵巢体积减小，部分卵巢间质增生（见图1）。

2.5 各级卵泡计数的变化 见表5。

2.6 卵巢组织中p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K含量的变化见表6、图2。

表5 两组大鼠各级卵泡百分比的比较（±s）

表5 两组大鼠各级卵泡百分比的比较（±s）

注：与对照组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别 动物（只）原始卵泡（%）次级卵泡（%）窦状卵泡（%）闭锁卵泡（%）对照组 6 34.53±4.08 24.09±3.88 21.50±5.71 19.87±3.14模型组 6 33.92±7.48 16.40±3.44▲▲ 12.64±4.90▲ 37.04±5.83▲▲

表6 两组大鼠卵巢p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K含量的比较（±s）

表6 两组大鼠卵巢p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K含量的比较（±s）

注：与对照组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

－P70S6K对照组 6 1.2436±0.1251 1.1761±0.0956 1.1323±0.072组别 动物（只）p－AKT p－mTOR p 6模型组 6 0.7058±0.1511▲▲ 0.7095±0.1867▲▲ 0.6740±0.1192▲▲

图1 卵巢组织形态学变化

图2 western－blot检测卵巢组织中p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K的表达变化

3 讨 论卵泡的生长发育是一个漫长而复杂的过程，从胚胎时期已经开始，原始卵泡发育至成熟卵泡以及排出，依次经过始基卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、排卵前成熟卵泡4个阶段，历时长达约1年。卵泡由1个居于核心的卵母细胞及周围的颗粒细胞和卵泡膜细胞所组成。在卵泡发育的过程中，颗粒细胞中FSH和LH受体表达逐渐增强，受体后的信号通路功能也逐渐完善，影响颗粒细胞在促性腺激素调控下增殖、分化，并促使卵母细胞不断成熟［3］。颗粒细胞可合成多种激素及生长因子，并表达其受体，进而调控卵泡的发育。卵巢颗粒细胞的增殖、分化、凋亡的机制及其调控非常复杂，涉及到复杂的分子作用机制和信号转导通路。

PI3K/AKT信号通路是一条与细胞增殖、分化密切相关的通路，近年来，许多学者借助基因突变动物模型研究该通路与卵泡发育的关系，取得了突破性的进展。当敲除卵母细胞中的PTEN基因（PI3K信号通路的终止信号），小鼠在成年早期即丧失生育能力，原始卵泡池中的卵泡过早耗竭，FSH、LH水平增高，卵巢体积变小，发生卵巢早衰［4］。而如果选择性破坏卵巢颗粒细胞中的PTEN，则会减少颗粒细胞的凋亡，并增加颗粒细胞的增殖，而且不会导致细胞肿瘤的发生［5］。可见在卵母细胞和颗粒细胞中均存在完整的PI3K/AKT信号系统，它们共同协调，调节着卵泡的生长发育、成熟和周期性的排卵。当敲除初级和次级卵母细胞中的PTEN，尽管卵母细胞中的AKT信号通路被激活，卵泡仍然继续生长发育至排卵，卵母细胞的成熟和受孕未受到影响；同样，敲除卵母细胞中的初级和次级卵母细胞中的PDK1（PDK1是催化AKT进行磷酸化反应的必须激酶），亦不影响卵泡的生长［6，7］。所以在卵母细胞中，PI3K/AKT信号通路对于卵泡的激活具有阶段特异性，仅决定着始基卵泡的静止、存活和激活；而颗粒细胞中的PI3K/AKT信号通路则对于卵泡的进一步生长发育和周期性的募集以及排卵则是非常重要的。

雷公藤为卫矛科植物，最早收载于《神农本草经》，其根茎为药用部位，雷公藤多苷（glucoside tripterygium wilfordine，GTW）又称雷公藤总苷，是其根芯提取物，具有抗炎、抑制免疫、抗生育、抗菌等功效，是目前临床上使用较多的非甾体类免疫抑制剂，被广泛用于治疗类风湿性关节炎、肾小球肾炎、红斑性狼疮及各种自身免疫性疾病和皮肤病［8，9］，其对女性生殖系统的影响主要表现为月经紊乱和闭经。基于临床中对于女性生殖系统的影响，许多学者利用动物模型，从不同层面研究雷公藤多苷对模型动物生殖系统的损害，已有多项动物实验研究结果表明［10～18］：雷公藤多苷可使实验大鼠、小鼠动情周期延长、紊乱甚至消失，体重下降，子宫、卵巢指数下降，卵巢中各级生长卵泡和黄体数目减少，闭锁卵泡比例升高；子宫肌层和内膜变薄，子宫内膜腺体含量减少；血清E2水平下降，FSH、LH水平增高；且随用药剂量增加及时间延长，损伤程度加重。本实验结果与既往实验研究结果相符，这些表现均与人类的卵泡发育障碍性疾病的表现相类似。

基于PI3K/AKT信号通路与卵泡发育的密切关系以及雷公藤多苷确切的抑制卵泡发育的实验结果，我们推测该信号通路可能参与了雷公藤多苷抑制卵泡发育的过程，为了验证这个的推测，选择从蛋白水平检测PI3K/AKT信号通路中的重要信号分子：AKT、mTOR、p70S6K 的活化形式p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K在卵巢中的表达，以期研究该信号通路在雷公藤多苷所致卵泡发育障碍模型中的变化，实验结果表明：模型组大鼠卵巢组织中p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K 水平均明显低于对照组（P＜0.01）。因此我们推测：PI3K/AKT信号通路可能参与了雷公藤多苷致模型大鼠卵泡发育障碍的过程，在该过程中，PI3K/AKT信号通路中重要的信号分子的活性均降低，其促增殖、分化的能力下降，因而使卵巢颗粒细胞正常的增殖过程受到抑制，分泌性激素能力下降，卵泡正常发育受阻，闭锁增多。卵泡发育是一个非常复杂的过程，受多种因素、多个环节的共同调控，涉及多条信号通路，如Smads、MAPK等信号通路，雷公藤多苷是否同时通过调控其他信号通路影响卵泡发育，还有待于进一步研究。

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