降糖三黄片对早期糖尿病肾病大鼠肾组织TGF－β1/Smad1信号通路的影响

江 丹 吴 伟 林明欣 朱章志

(1广东省第二中医院，广州，510095;2广州中医药大学，广州，5104053;3中国中医科学院，北京，100700;4广州中医药大学第一附属医院，广州，510405)

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并发症之一，糖尿病病程25年以上患者中DN的累积患病率为25% ～40%[1]。DN是导致终末期肾病(End Stage Renal Disease，ESRD)的重要原因，已经严重威胁糖尿病患者的生命健康。ESRD需要透析治疗，在欧洲发达国家20% ～40%的糖尿病患者最终发展为DN，成为透析治疗患者的首要原因[2]。虽然DN的发病机制非常复杂，但是学界对于DN肾脏病变的发生和发展与一些细胞因子和生长因子作用密切相关的学说，已基本取得了共识。在生长因子和细胞因子中作用最为突出的是转化生长因子－β1(Transforming Growth Factor－ β1，TGF－ β1)，它能够调节细胞及基质生长、分化，刺激细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)的分泌。Smads家族蛋白是将 TGF－β信号从细胞表面受体转导至细胞核的过程中起关键作用的蛋白。TGF－β/Smad信号通路最终会形成低聚体复合物，激活核内ECM成分如各型胶原Col－Ⅰ、Col－Ⅳ、纤维粘连蛋白(FN)等启动子的活性，从而增加ECM合成，导致肾纤维化。

降糖三黄片以桃核承气汤为底方，加黄芪、生地黄、玄参、麦冬等药物组成，具有益气养阴、泄热逐瘀的作用，对2型糖尿病及其并发症具有一定的疗效。在对糖尿病多种慢性并发症的研究中，本课题组发现加味桃核承气汤能改善DN患者糖、脂代谢紊乱，减少24 h尿蛋白排泄量、提高内生肌酐清除率[3]，减轻或延缓糖尿病鼠肾小球毛细血管基底膜的增厚[4]。降糖三黄片能改善胰岛素抵抗、降低DN大鼠尿蛋白、AngⅡ含量，抑制 DN 大鼠 PKC[5]和 TGF－ β1 的过度表达[6]，从而减少肾小球ECM的积聚，起到保护肾脏的作用。本研究的目的是通过大鼠实验观察降糖三黄片对血糖、24 h尿微白蛋白;TGF－ β1、Smad1、Co1－ Ⅳ的影响，以进一步研究其对ECM的影响及机制，为该方对DN的临床运用提供更加充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品、试剂及仪器 降糖三黄片为广州中医药大学院内制剂(批号:粤药制字Z20071185);厄贝沙坦片(赛诺菲杭州制药有限公司，进口药品注册证号:H20080074);链脲佐菌素(Streptozin，STZ，美国 Sigma公司);配制pH 4.2，0.1 mmol/L柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液。葡萄糖试剂盒(上海科欣生物技术研究所);TGF－β1采用ELASA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。尿微量白蛋白用全自动生化分析仪测定;Smad1 pAb抗体试剂盒(Bioword技术公司);Anti－Smad3 Antibody试剂盒、Anti－CollagenⅠ Antibody试剂盒及Anti－CollagenⅣantibody试剂盒(Abcam技术公司);DAB显色液、UltraSensitiveTMS－P超敏试剂盒(福建迈新生物技术开发有限公司)。TRIzol(批号:28223)、M－MLV First Strand Kit(批号:8212242)、PlatinumⓇSYBRⓇGreen qPCR SuperMix－UDG(批号:8212208)均由美国Invitrogen公司提供。特异性引物(上海英潍捷基贸易有限公司)。IQTM5型荧光定量PCR仪、SmartSpec Plus核酸蛋白测定仪(美国Bio－Rad公司)、Milli Q Plus超级纯水仪(美国Millipore公司)、BX51型光学显微镜(日本 Olympus)、MSHOT数码成像系统(MC－20，广州市明美光电技术有限公司)、MIAS医学图像分析管理系统(北京航空航天工业大学)。

1.2 DN动物模型的复制 SPF级SD大鼠80只，雌雄各半，体重180～220 g，由广东省医学实验动物中心提供。饲养于广东省中医药工程技术研究院SPF级动物实验室，温度21～24℃，湿度50% ～70%，雌雄分笼饲养，每笼4～5只;喂食SPF级鼠饲料，饮用无菌水。适应性喂养2周后，按随机数字表分为2组，空白对照组(正常组)11只，造模组69只。造模前禁食12 h，造模组按30 mg/kg剂量腹腔内注射STZ，正常组腹腔内注射等量柠檬酸缓冲液。72 h后各组大鼠眼眶静脉采血测定空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，且出现多饮、多尿、多食现象，确认为2型糖尿病模型。继续喂养8周至出现糖尿病大鼠的肾损害(电镜结果为证)。

1.3 分组、给药及喂养 造模成功的大鼠按随机数字表进一步分为模型组、厄贝沙坦组、降糖三黄片组。灌胃前用纯净水配制成1 mL混悬液配制药品(实验动物与人用药量换算公式:大鼠用量=生药量×0.018×5)。厄贝沙坦组0.027 g·kg－1·d－1剂量灌胃，1 次/d;降糖三黄片组 0.675 g·kg－1·d－1的剂量灌胃，1次/d;正常组及模型组灌服等剂量蒸馏水。给药8周后处死。中途死亡或不符合条件不列入统计分析，共35只大鼠完成实验，正常组10只，模型组8只，厄贝沙坦组9只，降糖三黄片组8只。

1.4 观察指标

1.4.1 一般生化指标检测 分别在治疗前、给药后4周、8周处死前称体重和眼眶静脉窦采血检测葡萄糖。于DN造模成功后、处死前，分别用代谢笼收集24 h尿液计算尿微量蛋白排泄量。处死后摘取肾脏，右侧肾脏去包膜称重，计算肾重/体重指数(肾重÷体重×100%)。取左侧肾脏一部分，用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，以便进行免疫组化分析;另一部分置－80℃冰箱中保存备用。

1.4.2 测定肾组织TGF－β1含量 取部分大鼠肾组织，采用双抗体夹心ELASA法测定TGF－β1含量。计算OD值，使用软件作图，根据样品OD值计算出相应TGF－β1含量。本次实验 TGF－β1公式:R2=0.985 6，y=－7E－08x2+0.000 3x+0.068 1。

1.4.3 检测肾组织Smad1、Col－Ⅳ免疫组化染色表达取石蜡切片，用二步法免疫组化染色检测肾组织Smad1、Col－Ⅳ表达。取200倍显微镜视野，以出现棕黄色颗粒为阳性性号，用MIAS医学图像分析管理系统进行统计分析。

1.4.4 荧光定量RT－PCR法检测肾组织Smad1、Col－Ⅳ基因表达量 取肾组织100 mg，液氮下研磨，然后加入1 mL TRIzol试剂，混匀后转移到1.5 mL离心管中，在室温下放置5 min。然后在4℃下12 000 r/min，离心10 min。取出上清液，转入新的1.5 mL离心管中，加入1/5体积的氯仿，用力混匀2 min，4℃下12 000 r/min，离心10 min。上清液转移到新的1.5 mL离心管，加入等体积异丙醇，放入－20℃冰箱静置0.5 h。取出后在4℃下12 000 r/min，离心10 min。弃上清，沉淀用1 mL 75%的乙醇洗涤2次后，在室温下干燥10 min。最后用200 μL灭菌超纯水溶解沉淀，并且用核酸蛋白测定仪测定OD260/OD280比值，算出RNA的浓度和纯度。反转录的操作按照Invitrogen公司MMLV First Strand Kit提供的实验方法进行，加入上述提取的总RNA，合成第一链cDNA。根据GenBank提供的基因序列设计特异性引物，引物设计利用Primer 5.0和Beacon Designer 7.91生物软件，用于扩增内参18S(GenBank Accession no.M11188)以及Col－I(GenBank Accession no.NM_053304)，Col－ IV(GenBank Accession no.NM_001135009)，Smad1(GenBank Accession no.NM_013130)，Smad3(GenBank Accession no.NM_013095)。设计的引物序列如下:18S引物:R(5'－3'):CAGACTTGCCCTCCA、F(5'－ 3'):ACGGCTACCACATCC;Col－I引物:F(5'－3'):CGATGGCGTGCTATGC、R(5'－3'):ACTTCTGCGTCTGGTGATA;Col－IV 引物:F(5'－3'):TACCTCACTGTCCACTATG、R(5'－3'):CTGTCTGTCCTTCTCCTT;Smad1引物:F(5'－3'):CGTGTTGGTGGATGGT、R(5'－ 3'):GATGTGTCGCCTGGTAT;Smad3 引物:F(5'－3'):ACTACAGCCATTCCAT、R(5'－3'):TTCTCCATCTTCACTCA.基因表达的检测按照所示组分进行添加，然后放入荧光定量PCR仪进行反应。将上述反应混合物放入PCR仪进行扩增。步骤1:94℃ ×5 min;步骤2:94℃ ×30 s→55℃ ×30 s→72℃ ×50 s(45个循环);步骤3:72℃ ×7 min。每组10个样品，分别取1 μL作为cNDA模板扩增，运用2－△△Ct法计算各组基因相对表达量。具体计算公式为:F=2－[(待测组目的基因平均Ct值－待测组内参基因平均Ct值)－(对照组目的基因平均Ct值－对照组内参基因平均Ct值)]

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件包分析系统，实验所得数值以均数加减标准差(±s)表示。多组间均值比较采用单因素方差分析，或重复测量设计的方差分析。若方差齐，组间均值两两比较采用LSD法;若方差不齐，改用Dunnett T3检验，α=0.05。

2 结果

2.1 一般生化指标比较 血糖比较:治疗前及治疗后第4周，正常组与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01);厄贝沙坦组、降糖三黄片组与模型组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。正常组与厄贝沙坦组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。治疗后第8周，正常组、降糖三黄片组与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)，厄贝沙坦组与模型组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，降糖三黄片组与厄贝沙坦组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。表明STZ造模后各组血糖明显升高，但相对于模型组、厄贝沙坦组，表明降糖三黄片能一定程度降低血糖，减轻高糖毒性(见表1)。

表1 各组大鼠治疗前后血糖比较(±s)

表1 各组大鼠治疗前后血糖比较(±s)

注:两两比较用Dunnett T3检验。与模型组相比，＊＊P＜0.01;与厄贝沙坦比较，△△P＜0.01。

组别 例数 血糖(mmol/L)治疗前 4周 8周正常 10 4.96±0.86＊＊△△ 5.24±0.87＊＊△△ 7.04±1.28＊＊△△0.000 0.000 0.000模型 8 29.42±3.89 39.78±4.45 50.30±5.51厄贝沙坦 9 26.04±3.92 36.59±5.03 47.08±6.14降糖三黄片 8 24.77±4.30 34.53±5.93 38.26±5.09＊＊△△F值 98.35 126.91 161.13 P值

治疗前各组体重比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。造模后4周、8周体重比较:正常组与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01);厄贝沙坦组、降糖三黄片组与模型组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。降糖三黄片组与厄贝沙坦组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

肾重/体重指数比较:正常组与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)，厄贝沙坦组、降糖三黄片组与模型组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，降糖三黄片与厄贝沙坦组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。肾重/体重指数比增大表明造模后各组大鼠均有存在肾肥大、肾损伤的情况，降糖三黄片与厄贝沙坦同样具有减轻肾脏肥大的作用(见表2)。

表2 各组大鼠治疗前后体重、肾重/体重指数比较(±s)

表2 各组大鼠治疗前后体重、肾重/体重指数比较(±s)

注:体重用两两比较用LSD法。肾重/体重指数用两两比较用Dunnett T3检验。与模型组相比，＊＊P＜0.01;与厄贝沙坦比较，△△P＜0.01。

组别 例数 体重(g)造模前 造模后4周 8周 肾重(g) 肾重/体重正常 10 194.05±13.39 230.13±12.27＊＊△△ 261.91±18.11＊＊△△ 0.87±0.06 0.00332±0.00017＊＊△△模型 8 194.00±7.57 166.05±11.39 152.11±21.11 0.91±0.05 0.00609±0.00073厄贝沙坦 9 196.22±11.15 175.41±18.57 157.53±21.91 0.84±0.11 0.00534±0.00048降糖三黄片 8 198.13±8.63 168.96±14.77 161.66±11.89 0.84±0.08 0.00521±0.00061 F值 0.29 40.9 74.7 1.669 47.157 P值0.832 0.000 0.000 0.194 0.000

治疗前各组尿微量白蛋白比较差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗后第8周，正常组、厄贝沙坦组、降糖三黄片组与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，正常组与厄贝沙坦组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)，降糖三黄片与厄贝沙坦组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。表明降糖三黄片能有效降低早期DN大鼠尿微量白蛋白，从而保护肾功能，且疗效与厄贝沙坦片接近(见表3)。

表3 各组大鼠治疗前后尿微量白蛋白比较(±s)

表3 各组大鼠治疗前后尿微量白蛋白比较(±s)

注:两两比较用LSD法。与模型组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与厄贝沙坦比较，△△P＜0.01。

组别 例数 尿微量白蛋白(mg/24 h)治疗前 8周正常 10 29.34±14.13 43.29±22.53＊＊△△0.628 0.000模型 8 24.62±10.18 403.28±134.09△△厄贝沙坦 9 23.55±10.66 245.74±130.43＊＊降糖三黄片 8 23.81±6.29 235.06±87.31*F值 0.59 19.02 P值

2.2 测定肾组织TGF－β1含量 治疗后第8周，正常组、厄贝沙坦组、降糖三黄片组TGF－β1含量与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。正常组、模型组与厄贝沙坦组相比差异具有统计学意义(P＜0.01);降糖三黄片组与厄贝沙坦组相比差异无统计学意义(P＞0.05)(见表4)。

2.3 检测肾组织Smad1、Col－Ⅳ免疫组化染色表达

光镜下免疫组化染色显示smad1阳性表达部位为肾小管上皮细胞胞质。正常组呈弱阳性表达(见图1A);模型组呈阳性表达增强，阳性颗粒为棕黄色(见图1B);厄贝沙坦组和降糖三黄片组比模型组阳性表达程度显著减弱(见图1C、图1D)。

Smad1染色指数比较:正常组、模型组、降糖三黄片组与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。正常组、模型组与厄贝沙坦组相比差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);降糖三黄片组与厄贝沙坦组相比差异无统计学意义(P=0.08)(见表4)。

图1 肾组织Smad1

光镜下免疫组化染色显示Col－Ⅳ阳性表达部位为肾小球毛细血管和肾小管基底膜。正常组呈阳性表达(见图2A);模型组阳性表达增强，阳性颗粒为棕黄色(见图2B);厄贝沙坦组和降糖三黄片组比模型组阳性表达程度减弱(见图2C、图2D)。

图2 免疫组化染色表达

表4 各组大鼠治疗后TGF－β1含量、Smad1染色指数、Col－Ⅳ染色指数比较(±s)

表4 各组大鼠治疗后TGF－β1含量、Smad1染色指数、Col－Ⅳ染色指数比较(±s)

注:两两比较用LSD法。与模型组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与厄贝沙坦比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01。

组别 例数 TGF－β1(pg/mg) 染色指数=平均光密度值×面密度值Smad1 Col－Ⅳ正常 10 265.23±84.49＊＊△△ 0.0382±0.0115＊＊△0.0529±0.0147＊＊△0.000 0.000 0.000模型 8 694.21±153.94△△ 0.0800±0.0164△△ 0.0849±0.0125△厄贝沙坦 9 429.87±146.60＊＊ 0.0565±0.0109＊＊ 0.0704±0.0132*降糖三黄片 8 390.86±100.91＊＊ 0.0599±0.0204* 0.0648±0.0156＊＊F值 18.372 11.734 7.876 P值

Col－Ⅳ染色指数比较:正常组、模型组、降糖三黄片组与模型组相比差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。正常组、模型组与厄贝沙坦组相比差异具有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);降糖三黄片组与厄贝沙坦组相比差异无统计学意义(P=0.076)(见表4)。

3 讨论

TGF－β的分布有一定的组织特异性，肾脏以TGF－β1为主，主要在肾小管上皮细胞，其次是肾小球。TGF－β1可直接刺激FN、Col－Ⅰ型和Col－Ⅳ的形成，体外细胞培养表明持续或间断的高糖环境可促使TGF－β1的产生和活化，TGF－β1可诱导 I、Ⅲ、Ⅳ型胶原及FN的表达[7]。此外，TGF－β1还能破坏肾小球滤过屏障，参与炎性反应、组织修复，促使肾小球硬化和肾间质纤维化，而这正是DN肾脏损害的基本病理机制[8]。本实验结果显示:造模后各组TGF－β1与正常组相比差异具有统计学意义 (P＜0.01)，正常组、模型组与厄贝沙坦组相比差异具有统计学意义 (P＜0.01);表明STZ造模后大鼠TGF－β1含量增加，而降糖三黄片、厄贝沙坦均能明显抑制DN大鼠肾组织中TGF－β1的表达，与既往研究结果一致[3]。

Smads家族蛋白是参与TGF－β超家族在细胞内信号转导的一组蛋白质，迄今为止，在哺乳动物已经分离鉴定的Smad蛋白有9种。Smads家族按功能可分成3类[9]:1)受体活化性或通路限制性 Smad(RSmads)，由于可以由活性的TβR激活发生磷酸化而得名，是专门转导 TGF－β家族中某条信号通路的Smad;2)共配偶体Smad，它是TGF－β族各类信号转导过程中共同需要的介质;3)抑制性Smad，它们也可与Ⅰ型受体结合，结合反应的稳定性比受体激活型Smad更强，因而限制受体激活型Smad被磷酸化，抑制信号转导过程。其中 Smad1作为 R－Smads，参与BMP信号转导，影响 Col－ Ⅳ表达[10]。Matsubara等[11]在体外证实了高糖状态下Smad1能够转录调节Col－Ⅳ的表达;同时证实，STZ诱导的糖尿病大鼠在24周时表现出程度不等的肾小球硬化;通过Western blot和免疫组化检测及相关性分析证实大鼠肾小球Smad1的表达水平与肾小球硬化的程度呈明显正相关，且与肾小球Col－Ⅳ和α平滑肌肌动蛋白(α－SMA)的表达密切相关。本实验治疗后第8周smad1基因表达量比较:模型组、厄贝沙坦组、降糖三黄片组与正常组相比有升高(P＜0.05)，厄贝沙坦组、降糖三黄片组与模型组比较降低(P＜0.05)。降糖三黄片组与厄贝沙坦组相比，P=0.08，虽无统计学意义，但分析数据考虑接近0.05，可能与实验例数过少有关，若增大例数重新统计，可能有统计学意义。

Col－Ⅳ是构成ECM的重要生化成分，也是肾小球基底膜(Glomerular Basement Membrane，GBM)的主要构成蛋白，约占GBM干体质量的50%，可决定GBM的强度及孔径选择性，故Ⅳ－C合成和降解异常势必影响肾脏结构与功能，DN时肾脏的Ⅳ－C表达增加[12]。Ziyadeh等证实体外高糖培养的肾近曲小管细胞和系膜细胞均有TGF－β1 mRNA表达及生物活性增加，同时分泌col－Ⅰ及col－Ⅳ增多，这种变化能被抗TGF－β1抗体抑制[13]。本实验治疗后第8周Col－Ⅳ基因表达量比较:模型组、厄贝沙坦组、降糖三黄片组与正常组相比有升高 (P＜0.05)，厄贝沙坦组与模型组比较降低有统计学意义 (P＜0.05);降糖三黄片组与模型组相比有下降，P=0.076，虽无统计学意义，但分析数据考虑接近0.05，可能与实验例数过少有关，若增大例数重新统计，可能有统计学意义。

中医认为糖尿病早期常有多饮、多食、多尿、大便干结或便秘等“胃肠燥热”的症状。发展至早期DN时，因大量蛋白从尿中丢失，出现尿浊 (蛋白尿);除此，多伴有血脂代谢紊乱、疲倦、肢麻等表现。早期DN病机以气阴两虚为本，胃肠燥热为标，兼夹痰湿、瘀浊[14]。从《伤寒论》六经辨证，提出DN当属五行中的“土”病及“水”病，因胃属于阳明，肾属于少阴。为阳明、少阴病热证，宜破血下瘀，急下存少阴之津，以求泻土布津。因降糖三黄片具有益气养阴、泄热逐瘀的作用，故用于早期DN治疗。研究结果表明降糖三黄片具有明显降低血糖、尿微量白蛋白的作用，与既往采用加味桃核承气汤水煎剂灌胃治疗的结论一致[3]。降糖三黄片还可通过抑制肾组织TGF－β1/smad1通路的表达，降低Col－Ⅳ的沉积，使肾脏的异常结构得到改善，降低肾重/体重指数比，延缓肾小球硬化。推测降糖三黄片可能是通过改善糖脂代谢紊乱，降低肾组织AngⅡ水平[5];同时，通过增加胰岛素敏感性[15]，降低血糖，减少AGEs沉积，从而抑制TGF－β1表达，抑制肾小管细胞肥大及肾间质成纤维细胞合成ECM，达到保护肾功能延缓DN发展的目的。这一结论是对降糖三黄片疗效的肯定，为临床应用降糖三黄片治疗早期DN提供了分子生物学理论依据。

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