响应面法优化玄参提取工艺研究*

黄萌萌 ，乔娟娟 ，邱亚玲 ，吴 刚 ，秦民坚 **

1中国药科大学中药资源学教研室，江苏南京 211198；

2中国药科大学教育部现代中药研究重点实验室，江苏南京 210009

中药玄参为玄参科植物玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根，始载于《神农本草经》，列为中品，具有清热凉血、滋阴降火、解毒散结的功效，用于治疗热入营血、温毒发斑、热病伤阴等症状[1]。现代药理研究表明，玄参具有镇痛、抗炎、抗菌、保肝、抗氧化、增强免疫等作用，其药理活性的主要物质基础是环烯醚萜苷和苯丙素类成分，如桃叶珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、6-O-甲基梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸等[2-6]。近年来以多指标成分表征中药品质成为中药质量控制的主要手段[7]，因此中药提取工艺的优化也应当以多成分为导向。周宏伟[8]等采用星点设计-效应面法，以环烯醚萜苷中哈巴苷、哈巴俄苷总提取率为指标，考察了玄参的提取工艺，研究表明，18%～32%乙醇，液料比20∶1～26∶1，提取30～48 min时，玄参总提取率最高。目前，玄参提取工艺的优化主要以环烯醚萜为考察指标进行优化，而对以环烯醚萜苷和苯丙素同时作为考察指标的提取工艺研究较少见。本研究建立了同时测定桃叶珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸等6个指标成分的HPLC方法，并以此6个指标成分总峰面积为响应值，采用Box-Behnken Design响应面分析法 （BBD-RSM）优化玄参的提取工艺，以期为玄参质量的全面控制提供理论依据。

1 材 料

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-M20A紫外检测器，四元泵，DGU 20A 5R脱气机，CTO－20AC柱温箱，SIL－20A自动进样器，Lab Solutions工作站 （岛津公司）；Sartorius BS 210 S型电子天平 （Sartorius）；BT 125D 分析天平 （Sartorius）；KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；优普超纯水系统 （成都超纯科技有限公司）；FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱 （上海博迅实业有限公司）；TDL大容量低速离心机（飞鸽）；Eppendorf Centrifuge 5417 R（德国 Eppendorf）等。

1.2 试剂与药品

乙腈（HPLC，Tedia）；磷酸（分析纯，南京化学试剂有限公司）；三蒸水（自制）；甲醇（分析纯，江苏汉邦科技有限公司）。桃叶珊瑚苷 （批号：MUST-12032606）、哈巴苷（批号：MUST-12121902）、哈巴俄苷（批号：MUST-12032606）、安格洛苷 C（批号：MUST-12051502），以上对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司；毛蕊花糖苷（批号：120622，上海士锋生物科技有限公司)；肉桂酸(批号：110786，中国食品药品检定研究院）。对照品纯度采用HPLC面积归一化法，均≥98%。

考察提取工艺所用玄参样品来源于浙江磐安，为新鲜玄参块根切片阴干所得。样品经本研究组通讯作者秦民坚鉴定为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的根。样品粉碎，过60目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件建立

2.1.1 色谱条件汉邦Merges C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；汉邦 C18预柱；流动相为乙腈（B）-0.03%磷酸水溶液（A），梯度洗脱程序如下：1%～2%B（0～5 min），2%～10%B （5～16 min），10%～14%B （16～21 min），14%～30%B（21～38 min），30%～56%B（38～48 min），56%～65%B（48～55 min），65%～90%B（55～60 min）。 流速 1.0 ml·min-1；柱温 30℃；检测波长：桃叶珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C为210 nm，哈巴俄苷、肉桂酸为280 nm；进样量10 μL。 对照品与样品色谱图见图1A、图1B。

图1 对照品（A）与样品（B）色谱图

2.1.2 线性关系考察精密称取对照品适量，加甲醇制成每毫升分别含桃叶珊瑚苷1.055 mg、哈巴苷0.395 mg、哈巴俄苷 0.41 mg、毛蕊花糖苷 0.35 mg、安格洛苷C 0.32 mg、肉桂酸0.175 mg的混合溶液，即得对照品混合储备液，将此储备液稀释配制成不同浓度的对照品溶液，取10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积作纵坐标，进样浓度（mg·mL-1）为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，计算即得回归方程及线性范围，结果表明线性关系良好。

2.1.3 精密度考察取同一对照品混合溶液连续进样5次，所得峰面积的RSD为日内精密度；同一样品连续进样3天，一天2次，所得峰面积的RSD为日间精密度。结果各成分色谱峰相对峰面积RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 供试品溶液制备取玄参粉末0.4 g，精密称定，置50 mL量瓶中，精密加入10 mL 90%甲醇，室温超声提取 30 min，3000 r·min-1离心 5 min，取上清液，残渣再加入10 mL 90%甲醇，重复上述操作，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度，摇匀，取提取液 13000 r·min-1离心 10 min，取上清即得。

2.1.5 稳定性试验取供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、12、24、48、72 h 进样，测定峰面积，计算得桃叶珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸含量的RSD分别为3.43%、1.17%、3.11%、3.92%、2.96%、0.62%， 表明供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.1.6 加样回收率实验取已知含量的玄参样品0.2 g，共9份，精密称定，按照高、中、低三个水平加入 150%、100%、50%量的标准品溶液，按“2.1.4”项下制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，计算其回收率。计算得桃叶珊瑚苷，哈巴苷、哈巴俄苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸的高、中、低三个水平的平均回收率为99.77%、103.35%、99.99% 、98.38% 、96.66% 、97.50% ，RSD 分 别 为4.63%、2.51%、1.98%、3.91%、1.66%、3.55%，表明方法准确可靠。

2.2 提取工艺考察

2.2.1 单因素考察结果见图2。

提取溶剂考察：取玄参粉末0.4 g若干份，精密称定，分别精密加入纯水10 mL，30%、50%、70%、80%、90%、100%甲醇各 10 mL，50%、70%、100%乙醇各10 mL，均超声30 min，提取两次，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。结果表明，90%甲醇提取总峰面积最大，不同浓度乙醇提取率均无80%、90%、100%甲醇提取率高。图2A表明随着甲醇浓度的增大，提取率显著增加，90%甲醇提取率最高，因此选择80%～100%甲醇作响应面优化。

提取方式考察：取玄参粉末0.4 g，精密称定，精密加入90%甲醇10 mL，分别超声30 min、热回流2 h、冷浸12 h，相同方式重复提取一次，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。图2B表明，超声与加热回流提取总峰面积高于冷浸法，加热回流提取率略高于超声提取，但超声提取可达到热回流提取率的97.6%，由于超声提取操作简单方便，因此选择超声提取。

图2 单因素考察结果

提取次数考察：取玄参粉末0.4 g，精密称定，精密加入90%甲醇10 mL，超声提取30 min，分别提取1、2、3次，合并上清液至50 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。图2C表明超声提取2次效果优于1次，而与3次没有显著性差异（P＞0.05），因此提取2次与三次效果相当，综合考虑，选择超声提取2次。

液料比考察：取玄参粉末0.4 g，精密称定，分别加入 5 mL、10 mL、15 mL、20 mL 90%甲醇， 超声提取，重复提取一次，合并上清液至50 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。图2D表明料液比从1∶12.5～1∶37.5 时，总峰面积（Total peak area）先增大，后逐渐减小；当液料比继续增大时，指标峰总峰面积继续降低。综合考虑提取成本等因素，选定液料比在 1∶12.5～1∶37.5区间内作响应面优化。 即 0.4 g药材分别加入5、10、15 mL溶剂。

提取时间考察：取0.4 g玄参粉末，精密称定，加入 90%甲醇 10mL， 分别超声提取 20、30、40、50 min，重复提取一次，合并上清液至25 mL容量瓶中，用90%甲醇定容至刻度。图2E表明超声提取30 min总峰面积最大，超声提取时间再延长，则总峰面积减小。因此选定超声时间在20～40 min区间作响应面优化。

2.2.2 响应面优化根据单因素实验考察结果，由于提取次数为非连续变量，回归处理比较困难，因此将提取次数定为两次，以甲醇浓度、提取时间、料液比作为考察变量，分别用X1、X2、X3表示。根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以6个指标成分总峰面积Y响应值，采用Design expert software软件设计三因素三水平的响应面试验，共17组实验，包括5组中心点实验，求取最优的提取工艺参数。具体试验设计方案和结果见表1、表2。

表1 BBD因素水平表

表2 BBD-RSM实验顺序与响应值结果（n=3）

采用Design-Expert 8.0.0软件对表2中的实验结果进行分析，结果表明二次多项式回归模型较优，对结果进行二项式拟合，主要成分提取的数学模拟如下：

式中Y为玄参主要活性成分提取率（以6个分析物的总峰面积值表示），X1为甲醇浓度 （%，v/v），X2为超声时间（min），X3为液料比（mL/0.4 g）。

当P＜0.05时，影响因素对响应值的影响为显著性差异，当P＜0.01时为极显著差异。对以上回归方程进行方差分析，结果见表3，可以看出模型的P值为0.0051，说明该模型得到的回归方程是显著的，失拟项值为0.3468，即方程模型失拟不显著，实验设计可靠，模型相关系数r2=0.9157，进一步说明模型具有较好的可信度。方差分析的结果表明方程的总模型、提取时间、液料比及甲醇浓度和液料比的二项式对玄参提取率的影响达显著水平，而交互项对提取率的影响不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，液料比＞超声时间＞甲醇浓度。

表3 BBD-RSM回归方程的方差分析表

图3是甲醇浓度、提取时间、液料比提取率的响应面曲面图。随着X1、X2、X3取值增大，响应值增大，当达到极值后，随着各因素值增大，响应值减小。由图3响应面曲面图可知该模型有稳定点，且稳定点是其最大值。利用Design-Expert软件中Point Prediction进行预测，可获得一组响应值最大的优化条件：甲醇浓度88.15%，提取溶剂14.49 mL/0.4 g（即液料比 36.23），超声 25.65 min，在此优化条件下，提取总峰面积预测值3.12×106，采用改良条件（甲醇浓度88%，液料比36，超声提取26 min）进行验证试验，结果平均提取总峰面积为3.11×106（n=3），与理论提取值接近，偏差小于1%。

3 小结与讨论

响应面法将回归方程作为函数估算的工具，将多因子试验中因素与试验结果的关系用多项式拟合，将因子与实验结果的关系函数化，克服了正交实验只能给出最佳因素水平组合而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷。由于其设计方法简单，实验结果精度高，响应面优化法在中药领域的应用越来越广泛[9-11]。

图3 响应面曲面图

本实验在参照文献[12]的基础上建立玄参中3种环烯醚萜苷（桃叶珊瑚苷、哈巴苷、哈巴俄苷）和3种苯丙素类（毛蕊花糖苷、安格洛苷C、肉桂酸）的同时测定方法，并以环烯醚萜苷和苯丙素类提取率为指标考察玄参的提取工艺。通过单因素实验，以及三因素三水平Box-Behnken Design响应面法实验，建立了提取率与各影响因素之间的数学模型。根据二次多项式回归模型，确定玄参的最佳提取工艺参数：甲醇浓度88.15%，液料比36.23，超声25.65 min，提取两次。理论值与实测值R偏差小于1%。该优化工艺可以为玄参质量全面控制及工业化提取提供参考。

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