青风藤醇提物与青藤碱治疗胶原诱导关节炎大鼠药效的比较研究*

姚 瑶，葛卫红

南京大学医学院附属鼓楼医院药学部，南京 210008

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种临床常见的以侵犯滑膜关节为主的炎性自身免疫病，其发病机制复杂，病变过程涉及多种细胞。青风藤，拉丁名Sinomenium acutum，是防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤茎[1]，具有祛风湿、通经络等作用，临床主要用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等免疫系统疾病。青风藤中包括如青藤碱（sinomenine，SIN）、 小 檗 碱 （berberine）、 青 风 藤 定 碱（sinomendine）等。青藤碱在青风藤中含量最多，高达2%[2]，具有抗炎、镇痛、免疫调节等作用，目前有青藤碱片和缓释片两种剂型在临床使用，治疗RA有效，可以一定程度地缓解关节炎症和抑制骨破坏。与此同时，其他一些成分也有镇痛、抗炎抗风湿成分以及免疫抑制的作用，都有可能对RA起到相关治疗作用[3]，如小檗碱是一种异喹啉类生物碱，具有广泛的药理作用，包括抗发炎。李宇馨等[4]研究表明，小檗碱通过抑制小鼠PGE2的产生，发挥抗炎和镇痛作用。Jeong等[5]研究发现小檗碱在巨噬细胞通过激活磷酸腺苷酶 （amp-activated protein kinase，AMPK）来抑制炎症反应。青风藤与青藤碱单体对RA治疗作用的比较鲜见报道。本研究考察和比较青风藤醇提物与青藤碱单体对胶原诱导关节炎大鼠治疗作用的差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级健康Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，雌性，体质量150～170 g，由浙江省实验动物中心提供，生产批号：scxk （浙）2008-0033，南京市鼓楼医院动物实验中心饲养，适应性喂养3天后开始用于实验。

1.2 试材与试剂

青风藤干燥藤茎（产于浙江，购于南京药业股份有限公司，批号：101028，经南京中医药大学吴启南教授鉴定为防己科植物青藤藤茎）；正清风痛宁片（湖南正清药业有限公司，批号：0907101）；天然牛Ⅱ型胶原蛋白（批号：C-7806）；完全弗氏佐剂（批号：C-9007）；IL-17酶联免疫吸附测定试剂盒 （批号：10090913）、RANKL酶联免疫吸附测定 （批号：10090909）、OPG酶联免疫吸附测定试剂盒 （批号：10090913），均购于美国Sigma公司。所用化学试剂均为色谱纯；实验用水为超纯水。

1.3 仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪及附件；ELx800吸收光酶标仪，美国BioTek公司产品。

1.4 色谱条件

色谱柱为 ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水（用磷酸及三乙胺调整pH至7.8）-乙腈（40∶60）；柱温为 30；流速为 1.0 mL·min-1；检测波长为 262 nm；进样量 20 μL。

1.5 试药的制备

青风藤干燥藤茎粉碎，12倍药量95%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并浓缩液，回收膏状溶剂，每毫升相当于生药50 g，加水稀释，使青风藤醇提物混悬液含2 mg·mL-1生药。正清风痛宁片研磨，加入适量乙醇，溶解，再加水制成2 mg·mL-1青藤碱的混悬液。

1.6 大鼠关节炎模型的制备

50只大鼠称体重后，随机分为对照组10只以及造模组40只。将溶于醋酸的Ⅱ型胶原蛋白先于4℃低温保存过夜，第二天与完全弗氏佐剂以等体积乳化。乳化成功后，对模型组大鼠背部及尾部多点行皮下注射，诱导类风湿关节炎模型，每只大鼠0.15 mL，7 d后进行第二次注射，方法与首次注射相同。对照组大鼠注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.7 关节评分

关节肿胀评分标准：关节处无肿胀，0分；趾关节微肿，1分；趾关节及足趾处发生肿胀现象，2分；踝关节以下的足爪发生肿胀现象，3分；全部足爪肿胀（包括踝关节），4分。大鼠最终分数为四肢关节肿胀分数总和，最高分为16分。首次免疫注射后每3天称重1次，每次固定两名实验员记录关节肿胀评分（arthritis index，AI）[6]。

1.8 分组与给药

造模第21天关节评分，AI＞4的认定为造模成功。其中8只未成模弃用，32只成模大鼠又随机分为模型组（n=12）和青风藤组、青藤碱组（n=10）。 开始给药：青风藤组灌胃给予青风藤醇提液，使青藤碱为 10 mg·kg－1·d－1；青藤碱组灌胃给予青藤碱的混悬液，使青藤碱为 10 mg·kg－1·d－1；模型组与对照组灌胃等量0.9%氯化钠溶液；持续36 d。

1.9 炎症因子测定

实验结束后，禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，ELISA法测定血清中白介素-17（interleukin-17，IL-17）、NF-κB 配位体受体活化剂（receptor or activator of NF-KB ligand，RANKL）以及可溶性蛋白骨保护素（osteoprotegerin，OPG）水平，按试剂盒说明书操作。

1.10 统计学方法

2 结 果

2.1 青风藤中青藤碱含量测定

在“1.4”色谱条件下，青藤碱得到较好的分离，无明显干扰峰出现，保留时间约为6.9 min，色谱图见图 1-A。 回归方程为：Y=19.836X+684.45，r2=0.9989，最低检测浓度0.12 mg·L-1。青藤碱的青风藤乙醇回流冷凝提取，醇提液超速离心15 min，上清液按照“1.4”色谱条件进样，色谱图见图1-B。根据醇提液中的青藤碱含量计算每百克生药中青藤碱的含量，青风藤中的青藤碱含量约为2%，与文献报道一致。继而用适量青风藤制成醇提液，浓缩成膏状，加入纯化水稀释，制成青藤碱含量为2 g·mL-1的混悬液。

图1 青藤碱色谱图（A）与青风藤色谱图（B）

2.2 大鼠关节评分

成模大鼠关节急性期表现为红、肿，以对称性后肢关节为著，累及踝关节、膝关节、趾间关节等，关节症状一般自后足首发，症状呈进行性加重，后肢在初次免疫后20 d左右出现第一个炎症高峰，即刻开始给药，每3天记录关节评分，见图2。药物治疗后，大鼠关节肿胀明显减轻，在整个治疗过程中呈显著下降趋势，而模型组大鼠关节炎评分一直居高不下，在第35天再次达峰，提示关节炎进入慢性状态。治疗结束第58天，模型组（model）大鼠关节评分高至7.5分，大鼠消瘦且皆蜷缩于角落，畏寒、足肿胀严重，而青风藤醇提物组 （QFT）和青藤碱组（SIN）大鼠均得到不同程度的缓解，见图3。且青风藤醇提物组关节炎评分低于青藤碱组（P＜0.05）。

图2 实验中各组大鼠AI变化趋势

图3 第58天模型组与治疗组的AI比较

2.3 各组大鼠血清IL-17、RANKL、OPG测定

青风藤醇提物组IL-17、RANKL水平显著低于模型组（P＜0.05），但未能降低到对照组水平；青藤碱组IL-17、RANKL未能得到很好的控制，与模型组无显著差异（P＞0.05）；青风藤醇提物组RANKL水平显著低于青藤碱组（P＜0.05）。青藤碱组和青风藤醇提物组OPG水平显著高于模型组（P＜0.05），其中青藤碱组OPG水平与正常组相比无显著性差异（P＞0.05）。 见表 1。

表1 各组大鼠血清IL-17、RANKL、OPG水平（pg·mL-1，±s）

表1 各组大鼠血清IL-17、RANKL、OPG水平（pg·mL-1，±s）

注：*表示与模型组比较P＜0.05， ＆ 表示与青藤碱组比较P＜0.05

组别 n IL-17 RANKL OPG对照模型青风藤醇提物青藤碱10 12 10 10 221.05±82.76*574.53±72.37 412.28±95.21* ＆ 544.79±81.23 126.76±37.85*202.16±20.16 167.44±14.68* ＆ 238.53±47.82 67.20±5.58*38.14±8.03 51.55±7.22*67.52±6.65*

3 讨 论

胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型由Trentham[7]于1977年首次报道，该模型经常用于研究治疗类风湿性关节炎的药物，本研究应用该模型探讨传统中药的醇提物与其有效单体在大鼠体内药效的差异。实验结果提示，青风藤醇提物与青藤碱均能有效缓解胶原诱导的关节炎肿胀，并且能够恢复关节功能；而青风藤醇提物能够有效降低IL-17、RANKL的分泌，提高OPG的水平；青藤碱对IL-17、RANKL的作用不显著，却能显著提高OPG水平。

IL-17是一种强大的前炎症细胞因子，也是炎症反应的微调因子，由Th17细胞分泌产生，可以刺激成纤维细胞、角质细胞、上皮及内皮细胞释放IL-6、IL-8、前列腺素E2（PGE2）、基质金属蛋白酶MMP等，还可诱导人成纤维细胞表达细胞间粘附分子（ICAM-1）, 促进T细胞增殖[8]。然而，目前并未有研究指出青藤碱能够直接抑制Th17的分泌，Yan LC等的研究表明，青藤碱低剂量时不能发挥其抗炎作用，反而青藤碱的一类衍生物能够显著抑制Th17的表达，从而减少IL-6、TNF-α的分泌，调节免疫。这与本研究结果类似，同时推测青风藤醇提物中是否存在与青藤碱结构类似的衍生物，能够发挥调节免疫的作用，有待进一步研究[9]。

类风湿慢性炎症的结果是骨破坏，最终致残，青藤碱与青风藤醇提物均能有效提高OPG水平，青风藤醇提物能够显著抑制RANKL的分泌。OPG与RANKL竞争性地结合到破骨细胞前体细胞的RANK上，抑制破骨细胞的活化。破骨细胞是RA骨破坏进程中发挥关键作用的细胞。RANKL来源于位于滑膜内膜层的成纤维样滑膜细胞 （fibroblastlike synoviocytes，FLS），它在RA病变中异常活化，是介导滑膜局部炎症的关键细胞之一，近年来研究发现它也是参与关节破坏的主要效应细胞[10]。本研究提示，青风藤醇提物和青藤碱均能通过改善RANKL/OPG的比值有效抑制骨破坏，青风藤醇提物的作用可能更为显著。Chen DP的研究表明，青藤碱能够抑制TNF-α诱导的VCAM-1在正常FLS与RA-FLS的表达，抑制IL-6分泌[11]。Ou Y的研究提示，青藤碱能够抑制RA-FLS的侵袭，并且降低MMPs的分泌，保护软骨和骨[12。

总之，青藤碱能够提高OPG水平，而青风藤醇提物对RANKL、IL-17分泌的抑制作用优于青藤碱，且青风藤醇提物中的系列生物碱成分的结构相似，都具有菲核结构，提示青风藤醇提物中可能存在其他青藤碱类似物，也能发挥抗炎抗骨破坏的作用，青风藤醇提物成分分析和具体机制仍有待进一步研究。

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