运动对肥胖大鼠脂肪细胞线粒体含量、活性及有氧代谢相关基因的影响

陈 平，郭艳华，刘文景，阴乃应，孙 剑

（1.吕梁学院 体育系，山西 吕梁 033000；2.新疆师范大学 体育学院，乌鲁木齐 830000）

随着我国居民高脂高能量饮食习惯的形成，居民普遍摄入总能量增多，再加上生活方式和生活节奏的改变，静坐增多，日常性的身体活动与主动的体育锻炼急剧减少，导致我国无论是青少年还是成人的超重、肥胖检出率逐年提高。而肥胖是引发高血压、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默氏症以及中风等代谢性疾病的独立危险因素［1］。因此，健康降脂已经成为世界医学界和生物科学界的研究热点问题。线粒体被认为是生物体内的“能量工厂”，是细胞内脂肪酸氧化代谢的核心细胞器，对于机体内能量平衡的维持十分重要［2］。研究发现，肥胖动物以及人类脂肪组织中线粒体DNA 拷贝数表达降低、线粒体的基因表达也较少；PCKB小鼠与C57 黑鼠（常用来研究糖尿病和肥胖症）杂交后，筛选得到PCKB缺乏的杂交小鼠比一般小鼠吃得更多，体重却比一般小鼠更轻，脂肪也少得多，但脂肪细胞内的线粒体数量增多，氧气消耗增多［3］。实验表明，在习惯久坐的肥胖成人中，对他们实施减体重和体育锻炼的联合干预后，其骨骼肌中的线粒体数量增加，体积扩大［4］；长时间耐力运动使大鼠骨骼肌线粒体的形态分布以及数量维持在适宜的动态平衡中［5］。那么，有氧运动是否会通过提高脂肪细胞线粒体的含量／活性以及氧化呼吸功能，从而达到控制体重的效用，鲜见报道。本研究旨在观察有氧运动后肥胖大鼠脂肪细胞线粒体数量及氧化呼吸功能的变化，以此探索有氧运动减肥的可能分子依据，为有氧运动能够降低体重提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

5周龄健康雄性SD 大鼠34 只，体重145—165g，随机分为对照组（HC，8 只）和高脂饮食组（HF，26 只），对照组给予普通饲料喂养，高脂饮食组给予高脂饲料喂养。自由摄食和饮水，室内平均温度21—23 ℃，相对湿度45%—55%，每日光照12 h。每周称体重一次，喂养12周。

普通饲料为常规啮齿类动物饲料。而高脂肪饲料为每100克普通饲料中加入全脂奶粉15g、猪油5g、黄肚豆15 g、鸡蛋黄50g、鱼肝油10滴、牛胆酸纳0.5g。

第12周末，选取体重超出正常对照组平均体重20%的大鼠16只，再随机分为肥胖对照组（OB）、运动组（E＋OB），每组8只。运动组大鼠除给予普通饲料喂养外，每天上午在流动水游泳池内无负重游泳1次。游泳池100cm×80cm×50cm，水速在前4周为1.4m／s，后4周为2m／s，水温24—25 ℃，训练前进行5天适应性游泳运动，持续时间为30min／次，之后每周训练5天（周六、日不训练），1次／d，60min／次，连续训练8周。所有大鼠均在游泳组大鼠最后一次训练24h后处死。

1.2 样本的采集

隔夜禁食后将大鼠称重（BW），用2%戊巴比妥纳（3 ml／kg）麻醉，断头处死大鼠，迅速取肩胛间区脂肪组织、睾周脂肪组织及腹膜后脂肪组织，用锐利眼科剪将腹膜后脂肪组织标本剪成2 mm×2 mm×2 mm 左右的脂肪组织块，一部分经37 ℃预热的PBS冲洗3次，4%的甲醛固定；另一部分－80 ℃冰箱保存。

1.3 线粒体含量测定

用普利莱法测定脂肪组织线粒体含量［6］。取固定后的脂肪组织块用PBS冲洗5次，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃孵育5—10min，冰上研磨后，转入离心管，800rpm 离心5分钟后，收集上清离心12 000rpm 再次离心10 min，按照BCA 蛋白定量试剂盒的说明书步骤进行线粒体含量测定。

1.4 ATP含量测定

ATP含量测定采用ATP测定试剂盒，具体操作步骤参照文献［6］进行。

1.5 COX 氧化酶活性测定

取脂肪组织块与研磨器内冰上研磨后，4 ℃环境下1 000r／min离心20 min，收集上清，按试剂盒说明书进行COX 酶活性测定。

1.6 组织总RNA 提取及RT－PCR

采用Trizol一步法提取细胞总RNA，经凝胶电泳显示28S清晰条带1 条，测定波长260nm、280nm 处的OD值，计算OD260／OD280 值和RNA 浓度，提取无污染无降解的RNAOD260／OD280值为1.8—2.0。经反转录反应后采用荧光定量RT－PCR 法检测腹膜后脂肪组织中Cytc mRNA、MDH mRNA、CPT1 mRNA 以及COX mRNA 表达水平。

从NCBI的nucleotide中查得目的基因和内参照基因，联系上海博亚生物技术有限公司设计上下游引物。引物序列如下：Cytc上游序列：5’CGAGTTCATGTACCGGGTCT3’，Cytc下游序列：5’CTGCGAGTGGTGGATTGT3’；MDH上游序列：5’ATGCCTTTGTTCTTGTTGG3’，MDH 下游序列：5’CCCCTTTCGCTTCTCCTG3’；CPT1 上游序列：5’ATGGTGGCGTTGGTGTTG3’，CPT1 下游序列：5’CCTTGTTGTCAGTTTGGGTAA3’；COX上游序列：5’AGGAAGGATTGGTGGAATG3’，COX下游序列：5’CTGAGCAGGAATAGTGGG3’；β－actin 上游序列：5’ACTGCCGCACTTCTCTTCCTC3’，β－actin 下游序列：5’CTCCTGCTTGCTGATCATC3’。退火温度分别为57 ℃、58 ℃、56 ℃、56 ℃和56 ℃。电泳带经过凝胶成像系统（Wealtec）拍照并用凝胶分析软件（Dophin－1D）分析。结果用特异基因和参考基因电泳带吸光度比值表示。

1.7 统计学方法

采用SPSS 10.0软件分析，全部数据均以均数±标准差（±SD）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA），选择Homogeneity－of－variance显示方差齐性，选择Tukey比较各组间差异，P＜0.05表示组间差异具有显著性。

2 结果

2.1 体重、肩胛间区脂肪组织、睾周脂肪组织的比较

肥胖组大鼠的体重、睾周脂肪组织较对照组大鼠显著增高，肩胛间区脂肪组织显著降低；运动组大鼠的体重、睾周脂肪组织较肥胖对照组大鼠显著降低，肩胛间区脂肪组织显著升高（表1、2和图1）。

表1 第八周后大鼠体重变化的比较（±SD）n＝8

表1 第八周后大鼠体重变化的比较（±SD）n＝8

注：与正常组相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；与肥胖组相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

组别 第八周 第十周 第十二周 第十四周 第十六章 第十八章 第二十周对照组 457±12.80 472±15.83 474±12.19 480±22.38 490±24.33 522±25.11 526±23.17肥胖组 451±11.04 495±17.54＊＊ 555±21.31＊＊ 565±26.05＊＊ 595±28.54＊＊ 607±26.43＊＊ 624±34.52＊＊运动组 451±10.47 495±13.67 555±23.42 558±21.56 545±27.17＃＃ 522±25.28＃＃ 509±28.45＃＃

图1 第8周后大鼠体重的变化（±SD）

表2 大鼠肩胛间区脂肪组织、睾周脂肪组织的比较（±SD）n＝8

表2 大鼠肩胛间区脂肪组织、睾周脂肪组织的比较（±SD）n＝8

注：与正常组相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；与肥胖组相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

组别 肩胛间区脂肪组织／g 睾周脂肪组织／g对照组81.19±23.18 82.47±25.63肥胖组 79.01±14.32＊ 96.55±26.10＊＊运动组 84.87±16.15＃ 84.94±19.73＃＃

2.2 线粒体含量、活性的比较

与对照组相比，肥胖组大鼠脂肪组织的线粒体含量、活性显著降低；与肥胖组大鼠相比，运动组大鼠脂肪组织中的线粒体含量、活性显著升高（表3）。

表3 大鼠脂肪组织线粒体含量、活性以及COX 活性的比较（±SD）n＝8

表3 大鼠脂肪组织线粒体含量、活性以及COX 活性的比较（±SD）n＝8

注：与对照组相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；与肥胖组相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

组别 mt含量 ATP含量 COX 活性对照组1.75±0.29 8.05±1.72 3.81±0.97肥胖组 0.59±0.27＊＊ 6.93±1.34＊＊ 2.45±0.58＊＊运动组 1.78±0.31＃＃ 7.88±1.49＃＃ 3.86±0.73＃＃

2.3 COX 活性变化

与对照组相比，肥胖组大鼠脂肪组织的COX 酶活性显著降低；运动组大鼠的COX 酶活性显著升高（表3）。

2.4 有氧代谢相关基因表达水平

与对照组相比，肥胖组大鼠脂肪组织线粒体有氧代谢相关基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表达水平显著降低；运动组大鼠脂肪组织线粒体有氧代谢相关基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表达水平显著升高（图2、3、4、5和 表4）。

图2 Cytc mRNA 在各组大鼠脂肪组织中的表达

图3 CPT1mRNA 在各组大鼠脂肪组织中的表达

图4 MDH mRNA 在各组大鼠脂肪组织中的表达

图5 COX mRNA 在各组大鼠脂肪组织中的表达

表4 大鼠脂肪组织线粒体氧化代谢相关基因表达水平的比较（±SD）

表4 大鼠脂肪组织线粒体氧化代谢相关基因表达水平的比较（±SD）

注：与正常组相比，＊：P ＜0.05，＊＊：P ＜0.01；与肥胖组相比，＃：P ＜0.05，＃＃：P ＜0.01。

组别 CPT1mRNA COX mRNA Cy tc mRNA MDH mRNA对照组 0.69±0.033 0.97±0.031 0.67±0.025 0.68±0.01 3肥胖组 0.54±0.017＊ 0.61±0.024＊＊ 0.51±0.021＊ 0.55±0.017＊运动组 0.73±0.022＃＃ 0.91±0.027＃ 0.70±0.023＃＃ 0.73±0.026＃＃

3 讨论

3.1 线粒体的形态、分布与功能特点

线粒体是真核细胞的一种重要的、高度动态结构的细胞器，形状多种多样，呈颗粒状、棒状或者线状，并且彼此之间相互连接，形成一个动态的管网状结构。线粒体主要存在于心肌、骨骼肌、肝脏以及棕色脂肪组织等能量需求较高、代谢较强的组织中。它通过呼吸作用，将生物大分子诸如碳水化合物、脂肪、蛋白质等氧化分解，从而产生能量，进而为机体细胞的代谢活动供能［7］。研究表明，遗传和环境因素在肥胖的发生和发展过程中扮演了非常重要的角色，但无论是哪种因素，肥胖最终都表现为皮下脂质积聚过多［8］。而脂肪细胞线粒体是脂肪酸β氧化的主要场所之一，是细胞内脂肪酸氧化代谢的核心细胞器，对于维持脂肪细胞内甘油三酯代谢尤为重要，当脂肪细胞线粒体功能发生障碍时，势必会影响到脂肪酸的β氧化过程，导致细胞内的脂肪酸大量聚集，进而抑制胰岛素信号传导通路，造成与肥胖有关疾病的发生发展［9］。因此，研究脂肪细胞线粒体功能，诱发脂肪细胞线粒体含量增生，提高脂肪细胞线粒体氧化呼吸活性，成为控制机体脂质沉积的热点问题。

3.2 线粒体与肥胖

肥胖是一种代谢性疾病，其发生的根本原因是能量代谢失衡，引起脂肪堆积，导致肥胖，由此导致发生癌症、心血管疾病、糖尿病及其他慢性疾病的风险大大增加。而做为细胞内脂肪酸氧化代谢的核心细胞器，线粒体数量的减少和氧化代谢活性的降低，势必影响到脂肪酸的消耗以及脂肪的分解。研究发现，肥胖大鼠及人类脂肪组织中mtDNA 拷贝数显著降低，线粒体基因表达水平显著减少；胰岛素抵抗者的线粒体数量显著降低，功能显著下降［10］；长期大量的ROS生成会改变肝脏和骨骼肌线粒体数量以及动态结构，导致线粒体功能失调，产生脂质积聚和胰岛素抵抗［11］。在激光共聚焦显微镜下，肥胖成人的脂肪细胞荧光强度显著降低，流式细胞仪检测结果显示肥胖者脂肪细胞荧光值明显降低，线粒体含量降低［12］。研究表明，过氧化物增殖体活化受体（PPARγ）激活剂不但使胰岛素抵抗得到改善，还能使脂肪细胞的分化及功能得到改善，增加脂肪细胞线粒体的生物合成，提高线粒体的活性［13］。db／db小鼠脂肪细胞线粒体蛋白、氧化磷酸化合酶的表达水平均显著下降，线粒体数量显著降低；ob／ob小鼠脂肪细胞线粒体不仅数量显著减少，且比正常小鼠要小得多，存在线粒体功能障碍［14］。线粒体是细胞内的能量转换器，通过糖酵解和磷酸化作用都可以产生ATP，因此，ATP 是反映线粒体状态及活性的指标。本研究结果发现，与对照组相比，肥胖组大鼠脂肪细胞的线粒体含量、ATP 含量、细胞色素氧化酶（COX）活性都显著降低；有氧代谢相关基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表达水平显著降低，表明肥胖大鼠脂肪细胞的线粒体含量减少，氧化呼吸活性减弱，与国内外研究结果一致。

3.3 运动与线粒体

线粒体是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，细胞有超过95%的能量都来源于线粒体的氧化呼吸作用［15］。随着细胞状态（增殖分化）以及周围环境（运动、寒冷）的变化，为适应不同状态的能量需求，线粒体的数量也会发生改变［16］。而有关运动对线粒体影响的研究主要集中在不同运动方式后骨骼肌线粒体的变化。研究表明，有氧运动可使骨骼肌线粒体数量增加，体积和呼吸功能增大增强［17］；长时间耐力运动可使人体骨外侧肌mfn1／2基因表达显著增加，线粒体数量以及氧化磷酸化能力增加；12周游泳运动使大鼠腓肠肌线粒体态3呼吸显著升高，Mfn2基因和蛋白表达水平显著升高，线粒体含量增加，线粒体有氧代谢能力升高［18］。习惯久坐的肥胖成年人经过减体重和体育锻炼干预后，骨骼肌线粒体数量增加，横断面面积上升，占肌纤维体积百分比增加，体积扩大［4］。短时间大强度的速度和力量项目的运动训练对骨骼肌线粒体的数量、结构和功能的影响不甚明显。另有研究报道，12 周跑台训练能够增强非酒精性脂肪肝小鼠肝细胞线粒体的ATP合成，态3呼吸升高，改善线粒体的功能［19］。有关运动对脂肪细胞线粒体的影响鲜见报道。

3.4 有氧运动、肥胖与脂肪细胞线粒体

动物实验发现，长期有氧运动可使肥胖大鼠机体消耗能量增加，体脂减少，可以有效降低肥胖大鼠的体重［20］。本研究结果发现，运动干预组大鼠较肥胖组大鼠体重显著降低，与前人研究结果一致。

研究表明，运动训练可以使线粒体体积增大，氧化酶活性增强，导致线粒体氧化呼吸活性的改变，增加运动过程中脂肪酸的氧化水平。耐力训练还可引起线粒体适应，使其脂肪酸氧化能力提高，并伴随线粒体中软脂酸氧化率及柠檬酸合成酶活性的提高［21］。有氧运动被广泛认为是一种合理有效的预肥减肥手段之一，而脂肪细胞线粒体是脂肪酸β氧化的主要场所之一，是细胞内脂肪酸氧化代谢的核心细胞器，那么，有氧运动是否通过影响脂肪细胞线粒体的含量及活性，从而达到健康减脂的效果，鲜见研究报道。本研究结果发现，经过8周游泳运动后，运动组大鼠脂肪组织中线粒体含量、ATP含量、细胞色素氧化酶（COX）活性都显著升高；有氧代谢相关基因Cytc、CPT1、MDH 和COX mRNA 表达水平显著升高。表明运动干预使肥胖大鼠脂肪细胞线粒体的含量、活性增加，氧化呼吸功能增强。

4 小结

肥胖大鼠脂肪细胞线粒体的数量、活性及氧化呼吸功能显著下降，肥胖大鼠存在脂肪细胞线粒体功能障碍；有氧运动干预可使肥胖大鼠脂肪细胞线粒体数量／活性、氧化呼吸功能增强；有氧运动可能通过提高脂肪细胞线粒体数量、活性、氧化呼吸功能而达到减轻体重的作用，是有氧运动控制体重与健康减脂的机制之一。

［1］Gunstad J，Strain G，Devlin M J，et al.Improved memory function 12 weeks after bariatric surgery［J］.Surg Obes Relat Dis，2011，7（4）：465－472.

［2］Karakelides H，Irving B A，Short K R.Age，obesity，and sex effects on insulin sensitivity and skeletal muscle mitochondrial function［J］.Diabetes，2010，59（1）：89－97.

［3］Lam J L，Jiang Y，Zhang T，et al.Expression and functional analysis of hepatic cytochromes P450，nuclear receptors，and membrane transporters in 10－and 25－weekold db／db mice［J］.Drug Metabolism and Pharmacokinetics，2010，38（12）：252－258.

［4］Toledo F G，Watkins S，Kelley D E.Changes induced by physical activity and weight loss in the morphology of intermyofibrillar mitochondria in obese men and women［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91（8）：3224－3227.

［5］罗齐军，刘紫荆，肖驰，等.ADRB2基因A46G 多态性与运动耐力相关性分析［J］.河北体育学院学报，2012，26（2）：80－82.

［6］吴媛，董菱月，安威，等.几种不同提取线粒体的方法对线粒体含量及活性的影响［J］.首都医科大学学报，2010，31（2）：241－244.

［7］周云，肖新华.脂肪细胞线粒体功能与肥胖［J］.国际内分泌代谢杂志，2011，31（2）：113－116.

［8］Walden P N，Timmons I G，Cannon J A.Hronic peroxisome proliferator－activated receptor gamma（PPARgamma）activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent，UCP1－containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes［J］.Biol Chem，2010，28（5）：7153－7164.

［9］张如.线粒体功能障碍与2型糖尿病的相关性及在脂肪组织的表现［J］.现代医药卫生，2010，26（14）：2163－2165.

［10］马慧娟，宋光耀.线粒体功能紊乱与胰岛素抵抗［J］.国际内分泌代谢杂志，2011，31（5）：321－323.

［11］Strobel N A，Peake J M，Matsumoto A.Antioxidant supplementation reduces skeletal muscle mitochondrial biogenesis［J］.Medicine and science in sports and exercise，2011，43（6）：1017－1024.

［12］高春林，赵亚萍，陈小慧.高糖对原代培养人脂肪细胞线粒体膜电位及胰岛素敏感性的影响［J］.医学研究生学报，2010，8（7）：805－808.

［13］Ohno H，Shinoda K，Spiegelman B M.PPARγagonists induce a white－to－brown fat conversion through stabilization of PRDM16protein［J］.Cell metabolism，2012，1（19）：395－405.

［14］Samuel V T，Beddow S A，Iwasaki T，et al.Fasting hyperglycemia is not associated with increased expression of PEPCK or G6Pc in patients with Type 2Diabetes［J］.National Acad Sciences，2009，106（29）：12121－12126.

［15］Karbowski M.Mitochondria on guard：role of mitochondrial fusion and fission in the regulation of apoptosis［J］.Adv Exp Med Biol，2010，68（7）：131－142.

［16］Chen H，Vermulst M，Wang Y，et al.Mitochondrial fusion is required for mt DNA stability in skeletal muscle and tolerance of mt DNA mutations［J］.Cell，2010，141（2）：280－289.

［17］Chomentowski P，Coen M P，Radikova Z，et al.Skeletal muscle mitochondria in insulin resistance：differences in intermyofibrillar versus subsarcolemmal subpopulations and relationship to metabolicflexibility［J］.J Clin Endocrinol Metab，2011，96（2）：494－503.

［18］葛耀君，谢敏，刘子泉.耐力训练对大鼠骨骼肌Mfn2蛋白表达及线粒体功能的影响［J］.中国运动医学杂志，2012，31（8）：706－710.

［19］Ding H，Jiang N，Liu H，et al.Response of mitochondrial fusion and fission protein gene expression to exercise in rat skeletal muscle［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1800（3）：250－256.

［20］Martin－Cordero L，Garcia J J，Giraldo E，et al.Production of IL－1βand IFN－γaffected by metabo－lic syndrome：an obese Zucker rat experimental animal mode［J］.European journal of applied physiology，2009，107（5）：535－543.

［21］Geng T，Li P，Okutsu M，et al.PGC－1αplays a functional role in exercise－induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber－type transformation in mouse skeletal muscle［J］.Cell Physiology，2010，298（3）：572－579.