海南野生疣柄魔芋组培快繁技术

潘登浪 曾宪海 邹积鑫 周立军　王军 吴志祥 李文 林位夫

摘 要 为开发利用海南本地魔芋种质资源，以海南本地野生疣柄魔芋球茎顶芽为外植体，研究其组培快繁技术。结果表明：外植体消毒以在0.1% HgCl2溶液中浸泡20 min为宜；采用MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L培养基，较有利于从顶芽基部直接诱导出丛芽，且增殖系数较高，达4.37；而丛芽分切成单芽后，在MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭1 g/L培养基上的生根率可达100%。

关键词 海南 ；疣柄魔芋 ；组织培养 ；耐荫植物

分类号 Q949.717.2

魔芋为天南星科（Araceae）魔芋属（Amorphophallus Blume）总称，为多年生宿根草本植物[1]。魔芋块茎经过加工，在食品、饲料、工业、医药保健方面有广泛用途[2-6]，深受广大人们的喜爱。中国魔芋有2 000多年的栽培历史，而国外始于20世纪初。据目前数据分析，国内魔芋产品市场有20亿元，日本年销售6 000亿日元，韩国、台湾、欧美魔芋产品市场有60亿～80亿美元[4，7]。魔芋通过无性繁殖进行繁育，生产上一般采用小种芋或将大块茎分切成小块茎繁育种苗，用种量大、增殖系数低、周期长，并且在贮藏、播种中易感病腐烂，同时由于种芋为营养器官多年留种累积病原容易造成种质退化，严重限制了生产的发展和新品种的推广。利用组培快繁技术可较好地解决这些难题，前人在魔芋组培快繁技术研究方面已有不少的报道[8-15]，但具有良好药用[16-17]、食用[18]、饲用价值[3]的疣柄魔芋的组培技术未见相关报道。海南本地野生疣柄魔芋种质资源具有耐荫、抗病、块茎大（单个球茎可达9 kg）等特点。鉴于此，本研究采用海南本地野生疣柄魔芋的球茎顶芽为外植体，开展组培快繁研究，以期建立海南本地野生疣柄魔芋的组培快繁技术体系，为海南省魔芋产业的发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料来源于海南省岛内自然阔叶林下的野生疣柄魔芋，采用其块茎顶芽作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 不同消毒时间对外植体的消毒效果

将新芽长1～2 cm的魔芋球茎清洗干净，切取带顶芽新生幼嫩组织，置于自来水下冲洗1 h，剥除外层老皮，再用清水冲洗1次后移植超净工作台上，按无菌操作规程对外植体进行消毒处理：外植体先用75%酒精浸泡30 s，再将其在0.1% HgCl2溶液中分别浸泡10、15、20、30 min，探索不同消毒时间对海南野生魔芋外植体消毒的效果。外植体经HgCl2浸泡后，用无菌水洗5次，再用无菌滤纸将外植体表面水分吸干，接种于A培养基上进行初代诱导培养。每处理接种20瓶，每瓶接种1块外植体，每个处理重复3次。培养30 d后，观察统计外植体的污染、死亡情况。

A培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+PVP（聚乙烯吡咯烷酮）1 g/L，pH6；培养条件：接种后外植体放置在温度（27±2）℃条件下暗培养10 d，再置于同等温度条件下连续弱光（光照强度1 000～1 500 lx，光照时间12 h/d）培养。

1.2.2 不同浓度的6-BA对丛芽的增殖效果

将经0.1% HgCl2浸泡20 min灭菌和在A培养基上培养30 d获得的无菌材料转接到添加不同浓度6-BA的增殖培养基CK、B1、B2、B3，探索不同浓度的6-BA对魔芋丛芽增殖的影响。每处理接种10瓶，每瓶接种2个芽，重复3次。培养60 d后，观察统计各处理对丛芽增殖的效果。

CK：MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7g/L，pH 6.0；B1：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 6.0；B2：MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 6.0；B3： MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 6.0。接种后培养条件：温度为（27±2）℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为12 h/d。

1.3 统计方法

数据采用Excel和SPSS软件进行统计分析。相关计算公式如下：

污染率=污染外植体个数/接种外植体个数×100%

死亡率=死亡外植体个数/未污染外植体个数×100%

丛芽增殖系数=继代培养后芽个数/原接种芽个数

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对外植体消毒效果的影响

海南野生疣柄魔芋球茎（图1）顶芽新生组织在0.1% HgCl2溶液中浸泡10～30 min，其不同消毒时间对外植体消毒效果不同。由表1可知，随着消毒时间的延长，污染率降低，但死亡率升高。消毒10、15 min时，无外植体死亡，但污染率很高，分别为81.65%和70%；消毒30 min时，污染率低，仅为15%，但死亡率高达68.35%；消毒20 min时，外植体污染率为33.35%，死亡率为5%。综合考虑污染率和死亡率的情况，以海南野生疣柄魔芋球茎顶芽新生组织为外植体，较理想的外植体消毒时间为20 min。另外，外植体在30 d的初代培养中，各处理均未产生侧芽或丛芽，部分顶芽有所萌长，仅芽鳞片开裂，未长出叶片（见图2）；各处理未出现外植体褐化现象。

2.2 不同浓度的6-BA对丛芽增殖的影响

将经0.1% HgCl2浸泡20 min灭菌和在A培养基上培养30 d获得的无菌材料转接到添加不同浓度6-BA的增殖培养基培养60 d，其丛芽增殖效果在0、1 mg/L差异不显著，3、5 mg/L与其他浓度间存在显著差异（见表2和图3），6-BA浓度为0～5 mg/L时，随着浓度的增大，增殖倍数先增大，在6-BA浓度达到3 mg/L时，增殖倍数最大为4.37，之后增殖倍数开始降低。6-BA浓度为5 mg/L时，增殖倍数为2.6，并且外植体长出愈伤组织。研究结果表明，6-BA浓度对海南野生疣柄魔芋球茎顶芽直接诱导丛芽效果明显，其较佳培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，pH 6.0。

2.3 生根壮苗培养

将丛芽分切成单芽，接种于生根壮苗培养基（MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L+活性炭1 g/L，pH 6.0）中。培养条件：温度为（27±2）℃，光照强度为2 000 lx，光照时间为12 h/d。生根壮苗培养20 d后，抽叶率和生根率均为100%（见图4）。

2.4 炼苗移栽

将经生根壮苗培养获得的具根、茎、叶组培苗移到室温、500 lx自然光下，打开组培瓶盖锻炼3 d，然后移出组培瓶，用清水洗去粘附于植株上的培养基，移栽于花盆（12 cm×15 cm）中，移栽介质组分椰糠∶表土=2∶1。移栽0～15 d，用薄膜密闭保湿，控制湿度90%以上，光照强度小于5 000 lx，移栽7 d后，开始长出新根。移栽15 d后，可掀开保湿膜进行常规管护。移栽30 d后，调查移栽成活情况，其成活率为96%（见图5）。

3 讨论与结论

海南野生疣柄魔芋球茎顶芽通常生长在高温高湿环境的土壤中，器官组织带菌较多，消毒难度大，消毒时间短达不到灭菌效果，消毒时间长对外植体伤害大，综合考虑后，外植体较为理想的消毒方法为：先经75%酒精浸泡30 s，再经0.1% HgCl2溶液浸泡20 min，最后用无菌水洗5次。 在本试验中，海南野生疣柄魔芋球茎顶芽外植体初代诱导中基本未发现褐化现象，不同于白魔、花魔芋、红魔芋外植体较易褐化[12，14-15]，可能是因为培养基中加入了PVP（聚乙烯吡咯烷酮），或海南野生疣柄魔芋球茎顶芽外植体本身多酚氧化物含量较少等，有待进一步研究。

植物激素对魔芋的生长发育起着非常重要的调节作用，适当的细胞分裂素与生长素比值有利于促进腋芽的分化与生长，比值过高或过低都不利于腋芽的分化和生长，本结果与胡悦等[9]对花魔芋的研究结果相一致。促进海南野生疣柄魔芋腋芽产生的适宜培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L。

本实验初步建立了包括外植体消毒及其初代诱导、丛芽增殖、生根诱导、驯化移栽的海南疣柄魔芋组培快繁技术体系，达到了魔芋种苗的规模化生产技术水平，对推动海南省魔芋产业的发展具有积极意义。

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