RAD51及CHK1在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义

张晓岚

[摘要] 目的 探讨RAD51及CHK1在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义。 方法 收集2012年1～12月于河北省眼科医院，经病理确诊且未经放化疗的喉鳞状细胞癌患者50例的癌组织、同一患者相对应的50例癌旁黏膜组织及17例非喉部恶性肿瘤疾病患者的喉部正常黏膜组织，采用免疫组化二步法检测标本组织中RAD51、CHK1的表达，分析二者间的关系。 结果 喉鳞状细胞癌组织中RAD51的阳性率（74.00%）明显高于相对应的癌旁黏膜组织（22.00%），差异有统计学意义（χ2=11.235，P = 0.014）；也高于非喉部恶性肿瘤疾病患者的喉部正常黏膜组织（17.64%），差异有高度统计学意义（χ2=12.346，P = 0.001）。喉鳞状细胞癌组织中CHK1阳性率（78.00%）高于癌旁黏膜组织（16.00%），差异有统计学意义（χ2=9.235，P = 0.041）；也高于正常黏膜组织（11.76%），差异有统计学意义（χ2=11.386，P = 0.010）；癌旁组织中CHK1的阳性率高于正常组织，但差异无统计学意义（χ2=1.245，P = 0.612）。RAD51的阳性高表达与喉鳞状细胞癌的病理分级、淋巴结的转移、临床分期有关（P < 0.05）；CHK1的阳性表达与喉鳞状细胞癌的病理分级、淋巴结的转移、临床分期有关（P < 0.05）。喉鳞状细胞癌组织中RAD51的表达与CHK1的表达呈正相关（r = 0.432，P < 0.01）。 结论 RAD51、CHK1在喉鳞状细胞癌组织中呈高表达，其表达与病理分级淋巴结的转移及临床分期有关，提示RAD51及CHK1的表达可能与喉鳞状细胞癌的预后和转移有关。

[关键词] 喉鳞状细胞癌；RAD51、CHK1；免疫组织化学

[中图分类号] R739.65 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）10（a）-0019-05

Epression and significance of RAD51 and CHK1 in laryngeal squamous cell carcinoma tissue

ZHANG Xiaolan

Department of Ear-nose-throat， Eye Hospital of Hebei Province， Hebei Province， Xingtai 054001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of RAD51 and CHK1 in laryngeal squamous cell carcinoma tissue. Methods From January to December 2012， in Eye Hospital of Hebei Province， 50 cases of carcinoma tissue from 50 patiens with pathologically confirmed laryngeal squamous cell carcinoma without chemotherapy， 50 cases of cancer adjacent normal mucosa tissues form the same patients and 17 cases non-malignant diseases's normal mucosa tisssue were selected， the expression of RAD51 and CHK1 in these tissue were deteced by two-step immunohistochemical methods. The correlation between RAD51 and CHK1 were analyzed. Results The RAD51 positive rate of laryngeal squamous cell carcinoma tissue （74.00%） was significantly higher than that of the cancer adjacent normal mucosa tissue （22.00%）， the difference was statistically significant （χ2=11.235， P = 0.014）， also higher than that of the non-malignant diseases's normal mucosa tisssue （17.64%）， the difference was statistically significant （χ2=12.346，P = 0.001）. The CHK1 positive rate of laryngeal squamous cell carcinoma tissue （78.00%） was higher than that of the cancer adjacent normal mucosa tissue （16.00%）， the difference was statistically significant （χ2=9.235，P = 0.041）； aslo higher than that of the non-malignant diseases's normal mucosa tisssue （11.76%）， the difference was statistically significant （χ2=11.386，P = 0.010）； the CHK1 positive rate of the cancer adjacent normal mucosa tissue was higher than that of normal mucosa tisssue， but the difference was not statistically significant （χ2=1.245，P = 0.612）. The RAD51 expression positive rate of laryngeal squamous cell carcinom tissue had related with the pathological grade， lymph node metastasis and clinical stage （P < 0.05）. The CHK1 expression positive rate of laryngeal squamous cell carcinoma had related with pathological grade of laryngeal， lymph node metastasis and clinical stage （P < 0.05）. The expression of RAD51 of laryngeal squamous cell carcinoma tissue was positively correlated with CHK1 （r = 0.432， P < 0.01）. Conclusion RAD51 and CHK1 showes high expression in laryngeal squamous cell carcinoma tissue， and its expression closely related with histological grade， lymph node metastasis and TNM stage. It suggests that RAD51 and CHK1 expression may be associated with laryngeal cancer prognosis and metastasis.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma； RAD51； CHK1； Immunohistochemistry

喉鳞状细胞癌是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤，恶性度高，易发生局部复发及远处转移，其发生、发展、预后及转移的研究已经成为了耳鼻咽喉-头颈外科的研究热点。细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）是在生物进化过程中极为保守的蛋白激酶，研究表明CHK1在人类许多恶性肿瘤中均有表达，可能与肿瘤的发生、发展及预后有关[1]。RAD51基因是细胞DNA修复系统中的重要组成部分，研究表明RAD51在人类许多恶性肿瘤中也呈高表达[2]。本研究应用免疫组织化学方法检测RAD51及CHK1在喉鳞状细胞癌组织、对应的癌旁正常黏膜组织及非喉部恶性肿瘤疾病患者的正常黏膜组织中的表达情况，并探讨二者间的关系，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2012年1～12月于河北省眼科医院（以下简称“我院”）手术治疗经病理确诊的喉鳞状细胞癌患者50例，切取其喉鳞状细胞癌组织及同一患者的癌旁正常黏膜组织50例。另收集同期我院手术治疗的非喉部恶性肿瘤疾病（如声带息肉等）患者的喉部正常黏膜组织17例。喉鳞状细胞癌患者中男47例，女3例；年龄46～79岁，中位年龄59.5岁；年龄≤59岁12例，年龄>59岁38例；癌肿直径≤2 cm 34例，>2 cm 16例；分型：声门上型17例，声门型32例，声门下型1例；病理学分级：G1+G2级29例，G3级21例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期31例；淋巴结转移者（N+）29例，无淋巴结转移者（N0）21例。非喉部恶性肿瘤疾病患者中男12例，女5例；年龄42～76岁，中位年龄56.2岁。喉鳞状细胞癌患者与非喉部恶性肿瘤疾病患者的年龄、性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会通过，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

采用免疫组织化学二步法。标本离体后1 h内采集，置入速冻管，迅速保存于-80℃冰箱内。将选取的50例喉鳞状细胞癌组织、对应的50例癌旁黏膜组织和17例正常喉黏膜组织常规福尔马林固定、石蜡包埋、4 μm切片。实验试剂包括CHK1兔抗人多克隆抗体、RAD51兔抗人多克隆抗体、兔二抗免疫组化试剂盒、鼠二抗免疫组化试剂盒、DAB显色液。用PBS代替一抗孵育切片为空白对照。

1.3 结果判定

RAD51及CHK1阳性染色是细胞浆中出现棕黄色或棕褐色异染颗粒，周围间质部分有着色为准，其中阳性染色结果的判断标准根据着色强度和阳性细胞百分率采用半定量积分法判断分析结果[3]。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。相关性采用Spearman相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 喉鳞状细胞癌组织、癌旁黏膜组织、正常黏膜组中RAD51、CHK1阳性率情况

喉鳞状细胞癌组织中RAD51的阳性率明显高于相对应的癌旁黏膜组织，差异有统计学意义（χ2=11.235，P = 0.014）；也高于非喉部恶性肿瘤疾病患者的喉部正常黏膜组织，差异有高度统计学意义（χ2= 12.346，P = 0.001）。喉鳞状细胞癌组织中CHK1阳性率高于癌旁黏膜组织，差异有统计学意义（χ2= 9.235，P = 0.041）；喉鳞状细胞癌组织中CHK1的阳性率高于正常黏膜组织，差异有统计学意义（χ2=11.386，P = 0.010）；癌旁组织中CHK1的阳性率高于正常组织，但差异无统计学意义（χ2=1.245，P = 0.612）。见表1。

表1 喉鳞状细胞癌组织、癌旁黏膜组织、正常黏膜组中RAD51、CHK1阳性率情况（例）

2.2 RAD51及CHK1在喉鳞状细胞中的表达与临床特征的关系

2.2.1 RAD51在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系 N+的喉鳞状细胞癌组织中RAD51的阳性率高于N0，差异有统计学意义（P < 0.05）。RAD51在Ⅲ、Ⅳ期喉鳞状细胞癌组织中的阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期，差异有统计学意义（P < 0.05）。RAD51在喉鳞状细胞癌病理分级G1+G2级组织中的阳性率低于G3级，差异有统计学意义（P < 0.05）。RAD51在吸烟量（支/d×年）>400和吸烟量≤400的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。RAD51在肿瘤直径≤2 cm和肿瘤直径>2 cm的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。RAD51在喉鳞状细胞癌的临床分型中的声门上型、声门型、声门下型的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。RAD51在喉鳞状细胞癌中年龄>59岁和年龄≤59岁的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。RAD51在男、女性喉鳞状细胞癌中的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。说明RAD51的阳性表达与喉鳞状细胞癌的病理分级、淋巴结的转移、临床分期有关，与吸烟量、肿瘤的大小、临床分型、性别及年龄无关。

表2 喉鳞状细胞癌组织中RAD51阳性表达与临床、病理特征的关系

2.2.2 CHK1在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系 CHK1在有N+的喉鳞状细胞癌组织中阳性率高于N0，差异有统计学意义（P < 0.05）。CHK1在Ⅲ、Ⅳ期阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期，差异有统计学意义（P < 0.05）。CHK1在喉鳞状细胞癌病理分级G1+G2级组织中阳性率低于G3级阳性率，差异有统计学意义（P < 0.05）。CHK1在吸烟量（支/d×年）>400和吸烟量≤400的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。CHK1在肿瘤直径≤2 cm和肿瘤直径>2 cm的阳性率分差异无统计学意义（P > 0.05）。CHK1在喉鳞状细胞癌临床分型有声门上型、声门型、声门下型中的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。CHK1在年龄>59岁和年龄≤59岁的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。CHK1在男、女性喉鳞状细胞癌组织中的阳性率差异无统计学意义（P > 0.05）。说明CHK1的阳性表达与喉鳞状细胞癌的病理分级、淋巴结的转移、临床分期有关，与吸烟量、肿瘤的大小、临床分型、性别及年龄无关。见表3。

表3 喉鳞状细胞癌组织中CHK1阳性表达与临床、病理特征的关系

2.3 喉鳞状细胞癌组织中RAD51表达与CHK1表达的关系

经Spearman相关分析显示喉鳞状细胞癌组织中RAD51的表达与CHK1的表达呈正相关（r = 0.432，P < 0.01）。见表4。

表4 喉癌组织中RAD51表达与CHK1表达的关系

3 讨论

喉鳞状细胞癌发病的重要机制之一是某些因素破坏了细胞的增殖、修复与凋亡之间的平衡。研究表明肿瘤细胞的耐药与其逃避凋亡及DNA的过度修复有关，而细胞的凋亡与细胞周期检测点调节有关[4]。在细胞周期检测点的调节中，CHK1起着非常重要的作用，RAD51是体内参与同源重组DNA修复的关键酶之一[5]。研究发现CHK1和RAD51在多种恶性肿瘤中表达均高于正常组织，因此检测喉鳞状细胞癌组织中CHK1和RAD51有助于为喉鳞状细胞癌的临床治疗、评估喉鳞状细胞癌预后提供依据。

3.1 RAD51表达与喉鳞状细胞癌间的关系

人类的RAD51蛋白主要功能是参与了DNA双链的修复和重组，在DNA双链进行链间转移置换时，RAD51是催化此过程的关键酶。研究发现RAD51水平下降降低了同源重组修复DNA双链的准确性，破坏了其他重组修复途径，使DNA损伤检查点平衡失调，引起基因组的不稳定，促进了肿瘤的发生，说明RAD51蛋白表达水平的失调促进了肿瘤的发生、发展[6-9]。许俊[10]采用免疫组化SP法检测60例肺鳞状细胞癌组织RAD51蛋白阳性率（33.33%）明显高于15例癌旁正常组织中RAD51蛋白阳性表达（6.67%）。本研究结果与上述研究一致。本研究显示：RAD51在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率明显高于癌旁黏膜组织及正常喉黏膜组织，提示RAD51在喉鳞状细胞癌组织中的高表达可能与喉鳞状细胞癌的发生、发展有关。且RAD51在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系显示：喉鳞状细胞癌晚期有淋巴结转移时，RAD51的表达增强，低中分化RAD51的表达增强，而在高分化中的表达相对较弱，病理分化程度越低RAD51表达越强，说明RAD51的表达越弱肿瘤的恶性程度就越低。RAD51还在有淋巴结转移组中有着高表达，提示它可能影响了肿瘤的转移，RAD51表达越高预后越差[13-14]。

3.2 CHK1表达与喉鳞状细胞癌之间的关系

CHK1是一种调控基因，主要参与了细胞周期中G2/M期的调控。当细胞的DNA双链发生损伤后，CHK1激活一系列过程，导致细胞周期阻滞。它同时还激活了DNA损伤的修复系统，最终维护细胞的稳定性，从而使细胞能够正常的增殖分化，避免了细胞的凋亡[15-16]。本研究结果表明：CHK1在喉鳞状细胞癌组织中的阳性率明显高于癌旁黏膜组织及非喉部恶性肿瘤的正常黏膜组织，但后二者表达无差异，提示CHK1在喉鳞状细胞癌组织中高表达可能与喉鳞状细胞癌的发生、发展有关。申帅[17]的研究表明CHK1蛋白表达有随Dukes分期提升而提高的倾向，癌组织与癌旁正常组织中CHK1蛋白的表达有显著差异，提示CHK1与结肠癌的发生发展及预后有密切关系。本研究CHK1在喉鳞状细胞癌中的表达与临床特征的关系显示：喉鳞状细胞癌到了晚期有淋巴结转移时，CHK1的表达明显增强，在低中分化中CHK1的表达增强，而在高分化中的表达相对较弱，病理分化程度越低CHK1表达越强，说明CHK1表达越强肿瘤的恶性程度就越高。CHK1还在有淋巴结转移组中明显高表达，说明它可能会影响肿瘤的转移，而有转移的肿瘤预后较差，进一步说明了通过监测CHK1的表达可能可以预测肿瘤的预后。

3.3 RAD51及CHK1在喉鳞状细胞癌中二者表达的相关性

本研究发现RAD51及CHK1在喉鳞状细胞癌组织中均为高表达，且RAD51及CHK1间呈正相关，但具体作用机制还有待进一步研究。

综上所述，RAD51及CHK1共同参与了喉鳞状细胞癌的发生及发展过程，二者可以作为恶性肿瘤的分期分级和判断恶性程度的标志，研究其表达可以为肿瘤患者的预后提供依据。

[参考文献]

[1] Berg RW. Tumor growth inhibitionin vivoand G2/M cell cycle arrest induced by antisense oligodeoxynucleotide targeting thymidylate syn-thase [J]. J Pharmacol Exp Ther，2001， 298（2）：477.

[2] 田勇泉，韩德民，孙爱华.耳鼻咽喉头颈外科学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2008：204.

[3] 闫静波.散发性大肠腺瘤癌变过程中Rad51和Chk1的表达及意义[J].诊断病理学杂志，2014，21（1）：25-28.

[4] 陈忠民.PTEN通过抑制PI3-AKT信号通路上调Rad51基因的表达[J].中国生物化学与分子生物学报，2009，2（24）：192-194.

[5] Krepela E. Expression of apoptosome pathway-related transcripts in non-small cell lung cancer [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2006，132（1）：57-68.

[6] Connell PP. Pilot study examining tumor expression of RAD51 and clinical outcomes in human head cancers [J]. Int J Oncol，2006，28：1113-1119.

[7] 高庆蕾，叶飞，谢大兴，等.灭活细胞周期检测点激酶增强乳腺癌细胞放疗敏感性[J].中国妇幼保健，2008，12（23）：4026-4028.

[8] Hannay JA. Rad51 overexpression conyributes to chem. Oresistance in hum an soft tissue sarcom a ceslls a role for p53/activator protein 2 transcriptional regulation [J]. Mol Cancer Ther，2007，6（5）：1650-1660.

[9] 马瑞波，杨大刚，孙诚谊，等.Chk1在原发性肝癌和肝非肿瘤组织中的表达[J].贵阳医学院学报，2012，37（5）：483-485.

[10] 许俊.DNA修复基因RAD51和ERCC1蛋白在人肺鳞癌中的表达意义[J].医学研究杂志，2011，3（3）：31-34.

[11] Bahassi EM. The checkpoint kinase ehkl and ehk2 regulate the functional associations between hBRCA2 and Rad51 in response to DNA damage [J]. Oncogene，2008， 27（2）：3977-3985.

[12] 姚宏亮，杨竹林，李永国.胃良恶性病变组织中CHK1和PLK1的表达及意义[J].中南大学学报：医学版，2010， 35（10）：1080-1084.

[13] 康安静，苗丽，靳耀峰，等.Chk1/2、Plk1及PCNA在良性、交界性和恶性卵巢上皮性肿瘤组织中的表达及意义[J].陕西医学杂志，2011，40（6）：660-663.

[14] 闫静波，卫茹.胃癌组织中RAD51及CHK1的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2013，29（10）：1128-1130.

[15] 彭亚婷，梅金红.Rad51与肿瘤关系的研究进展[J].临床与实验病理学杂志，2011，27（1）：86-89.

[16] 邓年丰，冯云枝.舌鳞癌组织中CHK1和RAD51的表达及其临床病理意义[J].口腔颌面外科杂志，2012，22（6）：393-396.

[17] 申帅.CHK1及RAD51在结肠癌中的表达及意义[J].中国现代医药杂志，2009，4（11）：1-4.

（收稿日期：2014-06-13 本文编辑：苏 畅）

[7] 高庆蕾，叶飞，谢大兴，等.灭活细胞周期检测点激酶增强乳腺癌细胞放疗敏感性[J].中国妇幼保健，2008，12（23）：4026-4028.

[8] Hannay JA. Rad51 overexpression conyributes to chem. Oresistance in hum an soft tissue sarcom a ceslls a role for p53/activator protein 2 transcriptional regulation [J]. Mol Cancer Ther，2007，6（5）：1650-1660.

[9] 马瑞波，杨大刚，孙诚谊，等.Chk1在原发性肝癌和肝非肿瘤组织中的表达[J].贵阳医学院学报，2012，37（5）：483-485.

[10] 许俊.DNA修复基因RAD51和ERCC1蛋白在人肺鳞癌中的表达意义[J].医学研究杂志，2011，3（3）：31-34.

[11] Bahassi EM. The checkpoint kinase ehkl and ehk2 regulate the functional associations between hBRCA2 and Rad51 in response to DNA damage [J]. Oncogene，2008， 27（2）：3977-3985.

[12] 姚宏亮，杨竹林，李永国.胃良恶性病变组织中CHK1和PLK1的表达及意义[J].中南大学学报：医学版，2010， 35（10）：1080-1084.

[13] 康安静，苗丽，靳耀峰，等.Chk1/2、Plk1及PCNA在良性、交界性和恶性卵巢上皮性肿瘤组织中的表达及意义[J].陕西医学杂志，2011，40（6）：660-663.

[14] 闫静波，卫茹.胃癌组织中RAD51及CHK1的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2013，29（10）：1128-1130.

[15] 彭亚婷，梅金红.Rad51与肿瘤关系的研究进展[J].临床与实验病理学杂志，2011，27（1）：86-89.

[16] 邓年丰，冯云枝.舌鳞癌组织中CHK1和RAD51的表达及其临床病理意义[J].口腔颌面外科杂志，2012，22（6）：393-396.

[17] 申帅.CHK1及RAD51在结肠癌中的表达及意义[J].中国现代医药杂志，2009，4（11）：1-4.

（收稿日期：2014-06-13 本文编辑：苏 畅）

[7] 高庆蕾，叶飞，谢大兴，等.灭活细胞周期检测点激酶增强乳腺癌细胞放疗敏感性[J].中国妇幼保健，2008，12（23）：4026-4028.

[8] Hannay JA. Rad51 overexpression conyributes to chem. Oresistance in hum an soft tissue sarcom a ceslls a role for p53/activator protein 2 transcriptional regulation [J]. Mol Cancer Ther，2007，6（5）：1650-1660.

[9] 马瑞波，杨大刚，孙诚谊，等.Chk1在原发性肝癌和肝非肿瘤组织中的表达[J].贵阳医学院学报，2012，37（5）：483-485.

[10] 许俊.DNA修复基因RAD51和ERCC1蛋白在人肺鳞癌中的表达意义[J].医学研究杂志，2011，3（3）：31-34.

[11] Bahassi EM. The checkpoint kinase ehkl and ehk2 regulate the functional associations between hBRCA2 and Rad51 in response to DNA damage [J]. Oncogene，2008， 27（2）：3977-3985.

[12] 姚宏亮，杨竹林，李永国.胃良恶性病变组织中CHK1和PLK1的表达及意义[J].中南大学学报：医学版，2010， 35（10）：1080-1084.

[13] 康安静，苗丽，靳耀峰，等.Chk1/2、Plk1及PCNA在良性、交界性和恶性卵巢上皮性肿瘤组织中的表达及意义[J].陕西医学杂志，2011，40（6）：660-663.

[14] 闫静波，卫茹.胃癌组织中RAD51及CHK1的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志，2013，29（10）：1128-1130.

[15] 彭亚婷，梅金红.Rad51与肿瘤关系的研究进展[J].临床与实验病理学杂志，2011，27（1）：86-89.

[16] 邓年丰，冯云枝.舌鳞癌组织中CHK1和RAD51的表达及其临床病理意义[J].口腔颌面外科杂志，2012，22（6）：393-396.

[17] 申帅.CHK1及RAD51在结肠癌中的表达及意义[J].中国现代医药杂志，2009，4（11）：1-4.

（收稿日期：2014-06-13 本文编辑：苏 畅）