复方五花血藤对鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用△

杨丹 余德立 余资江

视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)是临床上广泛关注的问题。视网膜组织代谢极为旺盛，其内层的血液供应又来自于终末分支的视网膜血管，因此对于缺血、缺氧极为敏感［1-2］。视网膜组织是视觉神经元所在处，一旦发生缺血、缺氧对视觉的损害极为严重，因此研究其发生发展机制对防治RIRI具有重要意义。RIRI的机制包括氧自由基学说、一氧化氮学说、钙通道学说、炎症反应学说、兴奋性氨基酸学说、基因调控学说、细胞凋亡学说等［3］。复方五花血藤(主方成分:五花血藤、透骨草、见血飞)具有清热解毒、活血、祛风、止痛等功效，药理学研究表明该药具有提高小鼠耐缺氧能力、扩张小动脉及抑制大鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的异常分泌等作用。本研究拟采用复方五花血藤灌胃大鼠，探讨其对 RIRI的保护机制，以期为临床应用该药治疗视网膜缺血性疾病提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取健康成年SD(Sprague Dawley)大鼠90只(无眼疾)，体质量 180～250 g，雌雄不限，由贵阳医学院实验动物中心提供［合格证号:SCXK(黔)(2002-0001)］。随机分成3组:正常对照组、模型组、治疗组，每组30只。其中模型组和治疗组大鼠制作RIRI模型;治疗组于造模前连续3 d给予复方五花血藤灌胃，每天2次(总剂量为10 g·kg－1·d－1);模型组和正常对照组灌服相同剂量的生理盐水。

1.2 主要仪器与试剂 LEICA RM2016转轮切片机(上海莱卡仪器有限公司)，OLYMPUS BH-2显微镜(日本OLYMPUS公司)，LKB-V型超薄切片机(第三军医大学电镜中心)，荷兰PHILIPS TECNAI10透射电子显微镜(第三军医大学电镜中心)，精密电子天平(德国Sartorius公司)。复方五花血藤(贵阳中医学院提供)，多聚赖氨酸(武汉博士德生物工程有限公司)，妥布霉素滴眼液(美国爱尔康公司)，盐酸丙美卡因滴眼液(比利时 s.a.Alcon-Couvreur n.v.公司)，survivin原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 复方五花血藤制剂的制备 取五花血藤20 g、透骨草15 g、见血飞15 g用纱布包扎，加500 mL蒸馏水煮2次，每次1 h，过滤，合并煎煮液。减压浓缩后真空干燥，得到复方五花血藤提取物。每次取提取物适量，用蒸馏水制备成含生药1 g·mL－1的药液，无菌密封后置入4℃ 冰箱中保存备用。

1.4 动物模型的建立 参照文献［4］的方法制作动物模型。具体方法:大鼠称体质量后以6 mL·kg－1给予50 g·L－1水合氯醛腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠侧卧位固定于实验台上，选取任一眼球，滴加复方托吡卡胺滴眼液散瞳，盐酸丙米卡因滴眼液表面麻醉5 min后，将一端连有生理盐水注射液的4号半头皮针从大鼠颞侧角膜缘斜刺入眼前房，固定针头并打开注射器。使输液瓶与眼球垂直距离为150 cm，眼压升高至 110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，这时可见大鼠瞳孔散大，巩膜变白。持续60 min，拔出针头，可见大鼠球结膜及巩膜颜色迅速恢复正常，检眼镜下视网膜血供恢复，瞳孔回缩，说明造模成功。术中及术后间断滴加妥布霉素滴眼液防止角膜干燥及预防感染。

1.5 光镜标本的制作 各组分别于造模后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h随机取5只鼠，过量麻醉后给予心脏灌注40 g·L－1多聚甲醛溶液处死大鼠，立即取出眼球，经Bouin液固定24 h(4℃冰箱)。取出标本后流水冲洗24 h，之后再由蒸馏水浸泡3次，每次10 min。取出后放于干净滤纸上，用眼科剪去掉角膜(保留晶状体以保持其形态)，修剪平整后放入体积分数75%酒精中过夜。第2天取出按以下步骤进行:体积分数80%酒精(2 min)，体积分数95%酒精Ⅰ(10 min)，体积分数95%酒精Ⅱ(10 min，去除晶状体)，体积分数100%酒精Ⅰ(10 min)，体积分数100%酒精Ⅱ(10 min)，二甲苯Ⅰ(15 min)，二甲苯Ⅱ(5 min)，65℃恒温箱中浸蜡(40 min，2次)，然后行石蜡包埋，包埋好的标本后端以视神经定位，行视网膜全层连续切片，厚度5 μm。

1.6 HE染色 于51℃水浴箱中摊片、捞片，然后放入70℃恒温箱中烤片2 h。HE染色步骤如下:从恒温箱中取出烤好的切片立即置于二甲苯Ⅰ(5 min)、二甲苯Ⅱ(5 min)、体积分数 100%酒精(5 min)、体积分数95%酒精(5 min)，蒸馏水冲洗擦干，苏木精染色(7 min)，蒸馏水冲洗擦干，体积分数0.5%盐酸酒精分色(即刻)，蒸馏水冲洗(5 min)，取出擦净，伊红染色(10 min)，蒸馏水冲洗擦干，再分别置于体积分数95%酒精(5 min)、体积分数100%酒精(5 min)、二甲苯(5 min)，取出载玻片自然风干后中性树脂封片，显微镜观察其形态结构。

1.7 电镜标本的制作 各组均于造模后72 h过量麻醉剩余大鼠，迅速摘取眼球，在冰浴环境中沿角膜缘切开，去除角膜及晶状体，冰生理盐水中冲洗干净，放入体积分数4%戊二醛中固定24 h(4℃冰箱)，送第三军医大学电镜室行透射电镜观察并摄片。

1.8 survivin原位杂交检测 使用 survivin原位杂交检测试剂盒对大鼠视网膜切片进行检测，不加探针者作为阴性对照，详细步骤见试剂盒说明书。此试剂盒采用针对survivin的寡核苷酸探针，经地高辛标记。针对大鼠 survivin靶基因的 mRNA序列为:(1)5’-ACCTTCAAGAACTGGCCCTTCCTGGAGGATTGCTC-3’;(2)5’-TTTCTGCTTTAAGGAACTGGAAGGCTGGGAACCGG-3’;(3)5’-ACAAAATTGCAAAGGAGACCAACAACAAACAGAAA-3’。

2 结果

2.1 HE染色结果 光镜下，正常对照组可看到视网膜各层结构完整，3层细胞核排列整齐，从外向内分别为:外核层(outer nuclear layer，ONL)、内核层(inner nuclear layer，INL)和神经节细胞层(ganglion cell layer，GCL)。其中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)呈单层排列，可见到较大完整胞体，胞核清晰;INL细胞数较少，有2～4层;ONL细胞数较多，有3～6层。各层细胞排列紧密、整齐，无组织坏死出现(图1)。模型组:再灌注6 h，GCL高度水肿，内丛状层(inner plexiform layer，IPL)明显增厚，结构疏松，细胞排列开始不规则;部分RGC和神经纤维层(nerve fiber layer，NFL)细胞发生空泡变性。再灌注12 h、24 h、48 h视网膜细胞持续高度水肿，主要表现在RGC和NFL细胞，但随着时间延长而逐渐减轻。再灌注72 h，损伤继续发展，可见到RGC减少，NFL明显变薄，INL细胞明显减少，部分结构不清晰(图2)。治疗组:再灌注 6 h，GCL和NFL较模型组细胞水肿减轻，IPL较模型组变薄;再灌注12 h、24 h、48 h视网膜各层水肿较模型组减轻，并逐渐消退，细胞排列较模型组整齐;再灌注72 h，IPL略有变薄，且明显较模型组轻(图3)。

Figure 1 HE staining of rat retina in normal control group(×200)正常对照组大鼠视网膜组织HE染色结果(×200)

Figure 2 HE staining of rat retina at different time after RIRI in model group(×200).A:6 hours;B:24 hours;C:48 hours;D:72 hours 模型组RIRI后不同时间大鼠视网膜组织HE染色结果(×200)。A:6 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h

Figure 3 HE staining of rat retina at different time after RIRI in treatment group(×200).A:6 hours;B:24 hours;C:48 hours;D:72 hours 治疗组RIRI后不同时间大鼠视网膜组织HE染色结果(×200)。A:6 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h

2.2 透射电镜观察结果 正常对照组:RGC形态规则，胞膜清晰，胞核内染色质分布均匀，胞浆内线粒体、内质网、高尔基复合体等细胞器丰富，结构完整;可见典型RGC轴突(图4A)。模型组:RGC高度肿胀，胞膜边界不清晰、不完整，细胞核核膜皱褶增多，核染色质浓缩，聚集于核膜附近，细胞器减少，线粒体肿胀，呈透明空泡(图4B)。治疗组:RGC形态大体正常，核膜、核仁清楚，胞浆内细胞器轻微肿胀，线粒体数量较模型组增多(图4C)。

2.3 survivin mRNA的表达结果 survivin mRNA的阳性颗粒主要存在于胞浆中，呈黄色或棕黄色不均匀分布，主要表达于 GCL、IPL和 INL。与正常对照组相比，模型组和治疗组survivin mRNA的表达在RIRI后6 h即开始增加，24 h达到高峰，以后逐渐降低，但各时间点均高于正常对照组(均为P＜0.05);而治疗组各时间点survivin表达均较模型组高，差异均有统计学意义(均为P＜0.05;图5、表1)。

表1 各组大鼠视网膜中survivin mRNA的表达Table 1 Expression of survivin mRNA in rat retinas of each group (¯x± s，n=6)

Figure 4 Transmission electron microscopy photograph of rat retina(×12 000).A:Normal control group;B:72 hours after RIRI of model group;C:72 hours after RIRI of treatment group 各组大鼠视网膜组织透射电镜图片(×12 000)。A:正常对照组;B:RIRI后72 h模型组;C:RIRI后72 h治疗组

Figure 5 Expression of survivin mRNA in rat retinas(×200).A:Normal control group;B:24 hours after RIRI of model group;C:24 hours after RIRI of treatment group;D:48 hours after RIRI of model group;E:48 hours after RIRI of treatment group 各组大鼠视网膜中survivin mRNA的表达(×200)。A:正常对照组;B:RIRI后24 h模型组;C:RIRI后24 h治疗组;D:RIRI后48 h模型组;E:RIRI后48 h治疗组

3 讨论

RIRI是视网膜在缺血损伤的基础上，恢复血流灌注后并不缓解视网膜细胞的损伤，反而加剧了细胞的死亡使损伤更严重的现象。研究表明，眼球的血液供应来自于视网膜中央血管系统和睫状血管系统，其中视网膜中央动脉分布于视网膜达锯齿缘，以营养视网膜内5层组织。黄斑部中心凹无血管分布，而由脉络膜毛细血管网供应营养，故我们不观察其结构。视网膜中央动脉属于终末动脉，没有侧支吻合，故在临床上此动脉发生病变的患者会造成相应区域的视网膜缺血，严重者可导致视力丧失。而视网膜的急性高眼压(如急性青光眼)，主要是对视网膜视神经的直接压迫从而造成供血障碍。

近年来国内外研究进一步说明了细胞凋亡与RIRI密切相关。细胞凋亡不是被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用［5］。survivin又称生存素，是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族的新成员，也是目前发现的最强的凋亡抑制因子［6］。survivin功能复杂，具有抑制细胞凋亡、促进细胞转分化并且参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用［7-10］。研究表明，survivin蛋白在心肌缺血再灌注损伤中对心肌细胞起到了很好的保护作用［11］。而研究也表明，其能够促进缺血再灌注损伤后器官内血管的生成［12］。survivin在膀胱癌、甲状腺癌及星形细胞瘤中也有高表达［13-15］。在本实验中我们可以观察到survivin mRNA的表达在再灌注6 h即开始增加，24 h达到高峰，以后逐渐降低，而治疗组survivin mRNA的表达各时间点都高于模型组。因此我们可以认为复方五花血藤在一定程度上能够激活survivin的表达，从而起到抑制凋亡的作用。

本实验所采用的复方五花血藤是贵州省传统中药的代表。复方五花血藤的组成是五花血藤、透骨草和见血飞，其中五花血藤又名大血藤，具有清热解毒、活血、祛风、止痛等功效。药理学研究表明，该药具有抗辐射作用，能显著增加小鼠心肌对86铷的摄取量，明显提高小鼠耐缺氧能力，扩张小动脉，减轻心肌梗死和改善心肌梗死所致的心肌乳酸代谢紊乱［16］。用大血藤治疗脑血管功能不良有一定疗效，并具有抗凝血作用。此外，大血藤还有镇静、抗急性过敏、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗癌等作用。研究表明大血藤可以抑制AA大鼠肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的异常分泌，从而阻止AA大鼠免疫性炎症的发展［17］。透骨草为较常用中药，具有祛风、除湿、舒筋、活血、止痛的功效，常用于风湿痹痛、筋骨挛缩、寒湿脚气、疮癣肿毒等症［18］。其药理作用有:抗炎镇痛、抗菌、抗过敏、抗肿瘤等［19-20］。见血飞具有祛风散寒、活血舒筋、镇痛等功效。研究表明，见血飞可缩短小鼠出血时间及血浆复钙时间，说明见血飞具有一定的止血作用［21-22］。近几年研究表明，对于RIRI，中医学者主要选择具有活血化瘀、益气活血等作用的中药来治疗［23］。鉴于复方五花血藤有以上作用，因此我们尝试性运用该药来探索其对于大鼠RIRI的疗效。

经过实验我们可以观察到:光镜下，正常视网膜结构清晰，排列规则。RIRI 6 h视网膜即发生组织学改变，表现在RGC等细胞发生空泡变性，IPL明显增厚，结构疏松，且细胞排列开始不规则。随着再灌注时间的延长，水肿减轻，NFL明显变薄，INL细胞明显减少，部分结构不清晰。而透射电镜显示其超微结构的改变主要表现为RGC的变性。在给予复方五花血藤治疗后，HE染色和透射电镜均观察到损伤减轻。因此我们可以初步判断复方五花血藤对于大鼠RIRI有一定的治疗效果，能缓解 RIRI造成的细胞水肿等症状，也能激活抗细胞凋亡因子survivin而起到一定的抑制凋亡的作用。其具体作用机制还有待于进一步探讨。本实验对于贵州传统中药的开发和利用起到了积极的作用。

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