异氟醚单凭吸入麻醉法用于糖尿病大鼠玻璃体注射的实验研究△

周小煦 宋文静 苏畅 吴建国

糖尿病性眼病危害极大，其中糖尿病视网膜病变位居不可逆性致盲眼底血管疾病的首位，根据比较医学的原则建立糖尿病大鼠模型［1］，进行玻璃体注射骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、药物等［2-3］，是目前防治糖尿病眼内病变的常用实验技术。但是，动物麻醉存在着一些困难，呈现眼病表现的糖尿病大鼠，除了高血糖状态，最少还需要6～8周以上的长期饲养和多次观察［4-6］。近年来常用的腹腔注射水合氯醛法为有创性操作，而反复腹腔注射麻醉，容易产生感染、肠粘连，甚至动物死亡。无创吸入药物如乙醚等，诱导麻醉后如不维持吸入，动物2～3 min就会苏醒，相对而言，一次普通大鼠玻璃体注射需5 min左右的操作时间，太短的麻醉时间不利于保证操作成功率;采用面罩维持吸入固然可延长麻醉时间，但大鼠头部太小，面罩完全阻碍了眼部操作空间;且乙醚有升高血糖的并发症［7］，也限制了其作为吸入性麻醉的用途。因此，目前尚无理想的用于糖尿病大鼠玻璃体注射操作的麻醉方案。

近年来，本研究小组一方面改进玻璃体注射技术，研制了大鼠角膜接触镜［8］，采取显微镜下的双手协调操作，提高成功率且缩短操作时间，一名熟练操作者仅需要3 min即可成功完成［9］;另一方面，借鉴其他吸入麻醉药物(异氟醚)在临床的应用经验，具有不升高血糖、恢复期无明显躁动、苏醒后少见恶心呕吐、麻醉时间也较长等优点［10-11］，这为理想的解决方案——单凭吸入麻醉法获得糖尿病大鼠玻璃体注射提供了可能性。本研究初步探讨此技术的安全性和有效性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠的造模与分组 健康同龄雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号:2002-0003，饲养于天津医科大学动物实验中心。55 mg·kg－1剂量尾静脉注射链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)制作 I型糖尿病大鼠模型，使用前用 0.1 mmol·L－1、pH值4.4枸橼酸缓冲液配置成20 g·L－1的 STZ溶液。造模后每周断尾取血1次，血糖仪检测大鼠血糖，以血糖稳定在 16.7 mmol·L－1以上为造模成功［6］。造模成功 8周后，选取 20只大鼠进入本实验，随机平均分为2组，每组10只，A组腹腔注射水合氯醛麻醉，B组异氟醚单凭吸入麻醉，由同一名熟练操作者给予右眼玻璃体内注射MSC。本实验所有操作均遵循天津医科大学的伦理学规定。

1.2 麻醉方法 A组:采用水合氯醛麻醉法，蒸馏水溶解水合氯醛晶体，配制成100 g·L－1溶液，按照4 mg·kg－1剂量从腹腔注射麻醉大鼠。麻醉时，左手抓住动物，大鼠的腹部向上，为避免伤及内脏，动物处于头低位，使内脏移向上腹，然后右手将注射针头于左(或右)下腹部刺入皮下，针头向前推0.5～1.0 cm，再以45°角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液。B组:采用异氟醚吸入法，麻醉诱导采用自制麻醉吸入筒(用透明玻璃制成，底部直径40 cm，高30 cm)实施(图1)，麻醉吸入筒一侧孔接Drager Fabius型麻醉机，另一侧孔接solar8000M型多功能监测仪监测流出气体中麻醉气体浓度。打开异氟醚挥发罐，新鲜气体流量为0.5 L·min－1，异氟醚挥发浓度为3.0%，待流出气体中异氟醚体积分数达到1.5%时，将大鼠放入筒内进行麻醉。2组动物麻醉起效后，将其移入小动物手术台上，侧卧搁置，周围环境维持在恒温(22±2)℃、湿度60%～70%、室内自然通风状态。

1.3 玻璃体内注射MSC的操作过程 同以往的描述近似［9］。简而言之，常规消毒铺巾，眼部滴表面麻醉剂，右眼滴一滴透明质酸钠，安置大鼠角膜接触镜，术者左手持镊子固定眼球，右手持已经抽取10 μL大鼠MSC的微量注射器，在大鼠角膜缘后1 mm进针穿刺进入玻璃体，显微镜下看清针尖后，1 min内缓缓推注药液，推注完毕后停留15 s拔针，再于6点钟位处角膜缘做前方穿刺，放出部分房水至眼压正常，操作结束。玻璃体注射成功标准:MSC推注完毕后，见晶状体后囊、玻璃体内有油滴状物，晶状体无扎伤，视网膜无大出血;巩膜穿刺口拔针后无明显液体漏出;前房穿刺后眼球形态完好。

Figure 1 Schema of anesthetic suction tube.The tube was made of glass with a light transmittance rate of 85%and the rats activities can be observed clearly.The tube had two holes and the upper intake hole connectted the anesthetic machine，the below outlet connected a multifunction tester 麻醉吸入筒示意图，玻璃材质，透光率85%，可以清楚观察到大鼠的活动情况，上方进气口连接麻醉机，下方出气口连接多功能检测仪

1.4 观察指标 比较2组动物的麻醉起效时间、肛温、呼吸频率、麻醉时间、死亡率、玻璃体注射操作成功率。麻醉起效时间:从动物接触麻醉药物至动物进入麻醉状态的时间。动物麻醉后以翻正反射消失和恢复作为动物进入麻醉状态和苏醒的标志。动物肛温:电子温度计测温探头涂凡士林以减少对动物直肠的损伤，在探头处做一标记，体温计插入直肠的深度以动物肛门外缘达到标记线为准，测量之前排尽直肠内的粪便，记录动物麻醉后1 min的肛温。动物呼吸频率:将大头针制成弯钩在大鼠剑突下钩挂腹部皮肤，用手术线连接到肌肉张力换能器上，使用BL-4生物机能实验系统记录麻醉起效后1 min内动物腹部呼吸的张力波数，计算呼吸频率。麻醉时间:从进入麻醉状态至苏醒的时间。动物死亡率=每组死亡动物数量/每组总量，具体指麻醉1 h内大鼠因麻醉而导致的意外死亡数量，各组死亡大鼠不纳入后续数据分析。玻璃体注射成功率=每组成功例数/每组总量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件分析数据，2组的麻醉起效时间、麻醉时间、肛温、呼吸频率的比较使用独立样本t检验，2组的操作成功率和动物死亡率的比较使用 Fisher’s精确检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般结果 30只SD大鼠糖尿病造模并饲养8周后，23只符合入选条件，以抛硬币法随机选择20只进入本实验。所有的糖尿病大鼠均呈现明显的饮食、饮水和尿量增加，而体质量增长缓慢甚至出现负增长的情况，毛质干枯，晶状体有轻度混浊(图2)。

Figure 2 Slit lamp observation of diabetes rat model after 8 weeks.The black arrow indicated slight cataract 糖尿病大鼠造模8周后，显微镜下活体观察，箭头指示处为晶状体混浊

2.2 相关指标比较结果 2组大鼠麻醉起效时间、麻醉时间、呼吸频率、体温见表1。2组大鼠的麻醉起效时间、麻醉后的呼吸频率、肛温比较，差异均无统计学意义(均为P＞0.05);A组麻醉时间明显长于B组，差异有统计学意义(P=0.01)。

表1 2组大鼠相关指标比较Table 1 Comparison of related indexes between two groups ()

表1 2组大鼠相关指标比较Table 1 Comparison of related indexes between two groups ()

Item Group A Group B Onset anesthesia time(t/min)3.75±0.63 4.78±0.47 Anesthesia time(t/min) 27.33±3.87 4.84±0.75 Breath frequency(min－1) 58.56±4.64 56.80±2.61 Anal temperature(T/℃)34.70±0.43 35.18±0.22

2.3 大鼠死亡率与玻璃体注射操作成功率 A组在麻醉后40 min发现意外死亡1只，死亡率10%(1/10)，B组均顺利苏醒，两组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);A组全部成功完成糖尿病大鼠玻璃体注射MSC，操作成功率100%(9/9)，B组有9只成功完成操作(图3)，成功率90%(9/10)，失败的1只大鼠原因在于晶状体后囊膜扎破，2组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

Figure 3 Photo of a successful intravitreal injection operation in group of inhalation anesthesia.The black arrow showed some MSC adhered to the posterior capsule without vitreous hemorrhage and lens injury 吸入麻醉组成功的玻璃体注射MSC操作照。显微镜下，玻璃体内无大出血，晶状体后囊膜完整，箭头处表示注射器针头推出的MSC在晶状体后囊膜附着

3 讨论

由于糖尿病大鼠造模6～8周以上才会出现眼部病变［4，6］，再行干预实验则需要更长周期，而高血糖结合麻醉、有创性操作、反复多次，明显属于高危险因素。本着“替代、优化、减少”的3R原则，选择一种简便、有效而无创的安全麻醉方法，将有助于提高实验动物福利。本研究采用经典的大剂量STZ尾静脉注射诱导大鼠糖尿病模型，入组大鼠血糖高于16.7 mmol·L－1，出现典型的体质量增长缓慢、毛发干枯、多饮多尿等体征，且眼部有白内障，提示糖尿病大鼠及眼部损害模型制备成功［1-6］。异氟醚是一种对中枢神经系统进行性下行性抑制的吸入性麻醉药物，见于大鼠腹腔脏器的麻醉报道［10-11］，本研究将其应用范围延展到糖尿病大鼠的眼内操作中。为避免药物浓度的误差，使用自制的麻醉吸入筒来控制异氟醚的浓度。结果表明，使用体积分数1.5%的异氟醚单凭吸入，糖尿病大鼠的麻醉起效时间与100 g·L－1水合氯醛(4 mg·kg－1)腹腔注射基本一致，麻醉后早期的大鼠生命体征，如肛温、呼吸，也与A组无明显差异，提示二者的麻醉效率等同。在早期研究成果基础上［8-9］，本实验采用了便利的大鼠角膜接触镜，研究者双手操作玻璃体注射，2组动物均能顺利完成上述实验，成功率在90%以上(9/9 vs 9/10)，提示麻醉效率足以保证完成玻璃体注射这一实验操作。

综上所述，异氟醚单凭吸入麻醉糖尿病大鼠，起效快，对动物呼吸频率、体温的影响小，麻醉过程中动物无痛苦，对于常规性、反复性、在5 min内能完成的糖尿病大鼠眼部检查操作(如裂隙灯显微镜照相、眼底照相、视网膜荧光血管造影、玻璃体注射)，推荐采用体积分数1.5%异氟醚吸入法，这对提高糖尿病大鼠眼病研究的效率具有重要意义。当然，异氟醚价格昂贵可能是其潜在的弊端。

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