屏边野生金线莲组培快繁技术研究

周 锐，孔 琼，薛春丽，高维明，普丽波，尹艳玲

（1.开远市人民政府发展生物产业办公室，云南开远661699；2.红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自661199）

金线莲（Anoectochilus formosanus）是兰科开唇兰属多年生草本植物，主要产于中国、日本、印度等东南亚国家，中国主要分布于福建、广东、广西、浙江、云南、贵州等省（区）[1～2]，素有“神药”、“鸟人参”等美称，是中国传统的珍贵药材，具有降血糖、滋阴降火、消炎止痛、调节内分泌、抗乳腺癌等疗效[3～4]。由于其株型小巧，叶型美观，叶脉金黄呈网状排列，也是观赏价值极高的室内观叶珍品。其生态分布较窄，主要生长于高海拔地区的深山密林下或溪涧旁潮湿的草丛中，呈稀疏、零星分部，很少成片密生；且种子微小呈粉末状，种胚发育不全，自然繁殖率低，加之人为肆意采挖，野生资源现已濒临枯竭，已不能满足医药临床的需要。

虽然国内外对金线莲的资源分布、药用价值、组织培养及其栽培技术等方面已经作了大量的研究[2～10]，为金线莲的进一步开发利用提供了参考。但在云南省关于金线莲的组培快繁技术还未成熟，还不太稳定。因此，文章采用云南屏边野生金线莲为试材，开展丛生芽诱导增殖培养研究，对提供药源和种苗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

来源于云南省屏边县的野生金线莲。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒处理

将外植体用洗衣粉溶液浸洗后用自来水冲洗数次，切取长0.5～1.0 cm的茎尖、带芽眼茎段作为接种材料，放入75%酒精消毒30 s，再用0.1%HgCl2溶液（或加入吐温-80） 中消毒7～10 min，然后用无菌水清洗5次，置于无菌滤纸上待用。

1.2.2 丛生芽诱导及增殖

将消毒后的接种材料于超净工作台上切成0.5～1.0 cm茎尖或带芽眼茎段（茎节） 接入培养基中，每个配方接种12瓶，每瓶接3个外植体。采用MS、1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂进行野生金线莲丛生芽诱导增殖培养配方筛选。诱导阶段是基本培养基筛选，其配方为MS+6-BA（0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L），1/2MS+6-BA（0 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、3 mg/L、4 mg/L、5 mg/L）；增殖阶段培养基配方为诱导阶段中的最佳培养基，主要是通过不同浓度的植物激素添加，对丛生芽诱导增殖情况进行比较，具体配方见表3。继代过程为将诱导阶段培养出生长良好的无菌苗接种到增殖培养基上进行培养。

1.2.3 壮苗及生根

当增殖苗长至3～4节时，进行壮苗及生根实验。其基本培养基为1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭[11]，添加香蕉泥、马铃薯汁、椰子汁3种天然有机物，观察其对金线莲幼苗生长的影响。上述每种培养基均接入无根幼苗10株，重复3次，统计每株净增加的叶片和发根数。

1.2.4 培养条件

整个试验过程均采用固体培养基，培养基中含3%蔗糖、0.7%琼脂，用0.1 M KOH将培养基pH值调为5.5～5.8。培养温度为25～28℃，光照时数为12 h/d，光照强度为1 000～1 500 Lx。30 d后观察丛生芽或苗生长情况。

1.2.5 炼苗移栽

选取植株长势基本一致，有2～4条根的试管苗于温室内按不同方法进行炼苗。封口方式：瓶苗置于室温下封口3 d，开盖6 d（喷水保湿）；松口方式：瓶苗直接开盖9 d（每3 d喷水保湿1次）。9 d后，取出植株，洗净培养基，用多菌灵可湿性粉剂800倍液处理 10 min 后植入泥炭∶腐殖土∶珍珠岩=1∶1∶1 配比的基质中，1个月后统计成活率。其试验条件为遮荫度50%的温室，空气相对湿度保持70%～80%。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对外植体污染率的影响

针对不同消毒方法处理发现外植体在茎尖和茎节添加吐温比不加吐温时灭菌效果更彻底，可降低污染率。由表1可看出，添加吐温可明显降低金线莲外植体的污染率，减少污染幅度达10%左右。

表1 不同消毒方法对外植体污染率的影响

2.2 适宜金线莲丛生芽诱导的基本培养基

根据表2可知，12种诱导培养基对丛生芽诱导发现不同的培养基配方对金线莲丛生芽诱导具有较大影响，其中1/2MS培养基优于MS培养基，在1/2MS培养基中当6-BA浓度为4.0 mg/L时，来自于茎节和茎尖的丛生芽增殖倍数达到最大，分别为1.2和0.8；且茎节诱导增殖率高于茎尖。当金线莲外植体在培养基中培养10 d时，茎尖的腋芽开始突出，并逐渐伸长，25 d左右腋芽的基部又长出新的腋芽，而一些带芽眼的茎段在25 d时能形成丛生状的小苗。因此适宜金线莲丛生芽诱导的基本培养基配方为1/2MS+6-BA 4.0 mg/L，且选用茎节为诱导的外植体材料。

表2 30 d后不同培养基对丛生芽诱导影响

2.3 金线莲丛生芽增殖试验

以1/2MS+6-BA 4.0 mg/L为基本培养基，添加不同浓度的NAA和2，4-D（表3），观察2种不同激素对金线莲丛生芽的增殖诱导。当NAA浓度为0.4 mg/L时，7 d后茎节的腋芽开始萌动膨大，芽不断伸展，逐渐形成主叶，极个别茎节上能诱导出2～3个不定芽，30 d后主芽长为1.8 cm，其基部也能再生侧芽。添加NAA的出芽率高于2，4-D处理的出芽率，平均高出2倍。而在添加2，4-D的培养基中，一般20 d后可肉眼观察到黄白色的小芽，随时间的延长逐渐转为绿色，出芽率低。当培养60 d后，增殖苗长势良好，不定芽较多。

表3 不同植物生长激素对金线莲芽增殖的影响

2.4 壮苗及生根

大量研究表明，较低浓度无机盐的基本培养基能提高组培苗的生根或炼苗移栽的成活率。笔者以1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭为基本培养基，添加3种不同浓度的有机添加物，探讨其对金线莲组培苗壮苗生根的影响。结果发现（表4），3种有机添加物均能让金线莲组培苗壮苗生根，香蕉泥的作用最大，椰子汁其次，最差为马铃薯汁；当香蕉泥浓度为200 g/L时，组培苗的发根数和叶片数最多，苗长势良好。

表4 不同有机添加物对金线莲壮苗生根的影响

2.5 炼苗移栽

在温室内采用松口和封口的炼苗方式对金线莲生根苗进行炼苗，从表5可以看出，不同的炼苗方法影响金线莲移栽成活率，封口炼苗成活率低于松口炼苗成活率。

表5 不同炼苗方式对苗移栽成活率的影响

3 讨论

获得无菌系是组培试验的首要基础。由于种植于室外的各种植物，其植株体内外携带较多的真菌和细菌，以致无菌系建立时污染率较高，因此可适当增加酒精和HgCl2灭菌时间或添加一些表面活性剂[6，12]，也可添加一些广谱性抗生素（庆大霉素、链霉素、卡拉霉素） 或杀菌剂（多菌灵、甲基托布津） 等方法[13]，以提高无菌系建立的效率。试验中以野生金线莲的茎段或茎尖为外植体，探讨添加吐温对灭菌效果的影响，结果发现当在HgCl2溶液中滴加吐温时，可以提高外植体的灭菌效果，且茎段的灭菌效果高于茎尖。其具体处理过程：经自来水冲洗后的茎节用75%酒精浸泡30 s后，再用0.1%HgCl2（100 mL中加1～2滴） 处理8 min时灭菌效果最好，此时污染率达11%，而茎尖的污染率为15%。

在植物组织培养过程中，基本培养基、激素种类及其浓度、有机添加物对植物丛生芽的诱导、增殖及其生根壮苗具有较大的影响。通过茎尖和带芽眼茎段2种外植体的丛生芽诱导试验发现，在同一种培养基处理中，带芽眼茎段的增殖倍数高于茎尖，因此金线莲丛生芽诱导的适宜外植体为带芽眼的茎段，这与宋丽莎[7]的结果相一致；在不同基本培养基处理中，1/2MS的培养效果优于MS培养基，金线莲丛生芽诱导的适宜培养基配方为1/2MS+6-BA 4.0 mg/L。生长素NAA或2，4-D的添加能显著促进丛生芽的增殖和生长，NAA的效果优于2，4-D，适宜丛生芽增殖的配方为1/2MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L。在壮苗生根阶段，3种有机添加物能明显改善金线莲的生长状况，其中当香蕉泥浓度为200 g/L时，组培苗的长势最好，这与前人的研究结果相符[8]，因此金线莲的壮苗生根培养配方为1/10MS+NAA 0.5 mg/L+0.05%活性炭+200 g/L香蕉泥。

由于金线莲组培苗是在人为控制的理想环境中培养，当移栽到大田间种植时，需要进行人工驯化，适宜的炼苗方法有利于提高金线莲组培苗的移栽成活率[9～10]。笔者采用封口和松口2种方式对金线莲组培苗进行温室内锻炼，其中松口的炼苗方式能提高移栽成活率。

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