川贝清肺糖浆质量标准研究

薛非凡，曾 丽，王丽玉，李炳森

(1．湖北省襄阳市食品药品监督管理局，湖北 襄阳 441021;2．湖北省襄阳市第五人民医院，湖北 襄阳441000;3．珠海正太制药有限公司，广东 珠海 519110)

川贝清肺糖浆由枇杷叶、苦杏仁、川贝母、麦冬、地黄、甘草、桔梗、薄荷组方，功能主治为清肺润燥、止咳化痰，用于治疗风热感冒引起的燥咳、咽干、咽痛。其收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂(第二册)》，标准编号为WS3-B-0184-90，原标准无鉴别和含量测定。笔者增加了苦杏仁的理化鉴别，枇杷叶和甘草的薄层色谱鉴别及甘草酸的含量测定[1-10]，该方法可以更好地控制产品质量。

1 仪器与试药

LC-10A型高效液相色谱仪(日本岛津)，包括SPD-10AVP紫外检测器、CBM-102工作站;CP-225D型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);ZF紫外分析仪(上海康华生化仪器制造厂);KQ-100B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。枇杷叶对照药材(批号为121261-200502)，甘草对照药材(批号为 120904-200512)，甘草酸单铵盐对照品(批号为110731-200614)，均购自中国药品生物制品检定所;硅胶G(青岛海洋化工厂);甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸、冰醋酸、醋酸铵、三硝基苯酚、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚(60～90℃)、乙醇、丙酮，均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 理化鉴别(苦杏仁)

取本品适量，置试管中，试管中悬挂1条三硝基苯酚试纸[取三硝基苯酚适量，制成饱和水溶液，将滤纸条浸入其中，湿透后，取出，阴干，即得;临用时，浸入碳酸钠溶液(1→10)中，使均匀湿润]。用软木塞塞紧，置温水浴中，20 min后试纸显砖红色。另取苦杏仁阴性样品，同法操作，试纸不变色，阴性无干扰。

2．2 薄层色谱鉴别

枇杷叶:取本品30 mL，加水饱和的正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨试液萃取2次，每次30 mL，弃去水层，正丁醇液加正丁醇饱和的水30 mL洗涤1次，弃去水层，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含枇杷叶的自制样品30 mL，同供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。另取枇杷叶对照药材2 g，加水100 mL，加热，保持微沸30 min，滤过，滤液浓缩至约30 mL，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验[4]，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-丙酮(15∶7)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，缺枇杷叶的阴性样品无干扰(见图1 A)。

图1 薄层色谱图

甘草:取本品10 mL，加水10 mL，摇匀，加乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加乙醇至1 mL，作为供试品溶液。取不含甘草的自制样品10 mL，同供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。另取甘草对照药材0．5 g，加水30 mL，加热，保持微沸30 min，滤过，取滤液同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。照薄层色谱法[2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB]试验[4]，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(12∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，缺甘草的阴性样品无干扰(见图1 B)。

2．3 甘草酸含量测定

2．3．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Discovery C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2);流速:1 mL/min;柱温:27℃;检测波长:250 nm。理论板数按甘草酸峰计算应不低于3 000。

2．3．2 溶液制备

精密吸取本品5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇40 mL，超声处理15 min，放冷，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。精密称取甘草酸单铵盐对照品适量，加甲醇制成每1 mL含 40 μg 的溶液(折合甘草酸为 39．18 μg)，即得对照品溶液。

2．3．3 方法学考察

图3 高效液相色谱图

测定波长选择:取甘草酸单铵盐对照品溶液适量，加甲醇制成适宜质量浓度的供试品溶液，于紫外分光光度计上扫描测定。结果在348．2 nm和249．0 nm波长处有最大吸收，参照中国药典及相关文献，选用250 nm作为测定波长。

干扰试验:分别精密吸取样品和不含甘草的阴性样品溶液各10 mL，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液和阴性对照品溶液，分别吸取10 μL，注入液相色谱仪。结果在甘草酸峰相应的位置上，仅有微小色谱峰出现，其峰面积仅为样品峰面积1．67%，表明阴性样品对本品含量测定无明显影响(见图2)。

线性关系考察:精密称取甘草酸单铵盐对照品0．011 2 g，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，得224 μg/mL的对照品溶液，精密吸取此溶液 20，5，5，5 mL，分别置 25，10，25，50 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得 179．2，112，44．8，22．4 μg/mL的对照品溶液，精密吸取以上对照品溶液各10 μL，分别注入色谱仪，测定峰面积。以甘草酸单铵盐质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为 Y=641 433．1X-3 985．1，r=0．999 9(n=6)。结果表明，甘草酸单铵盐进样质量浓度在0～224 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验:取同一对照品溶液，连续进样6次。结果峰面积分别为 242 296，243 916，244 139，245 168，250 999，250 961，平均 246 246．5，RSD=1．54%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，在 0，2，4，6，8，10 h 时进样测定。结果峰面积分别为 183 831，184 960，183 008，182 890，182 141，181 150，平均 182 996．7，RSD=0．72%(n=6)，表明供试品溶液在10 h内保持稳定。

重复性试验:取同一批样品6份，每份5 mL，依法制备供试品溶液并测定。结果样品含量分别为 0．344，0．345，0．343，0．344，0．339，0．341 g/L，平均 0．342 g/L，RSD=0．58%(n=6)，表明方法的重现性良好。

加样回收试验:取已知含量的样品(含量为0．342 g/L)6份，分别添加甘草酸单铵盐对照品溶液(0．252 g/L)适量，按拟订方法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 甘草酸加样回收试验结果(n=6)

耐用性试验:考察改变流动相中有机相的量(±5%)、流动相的 pH(±0．2)、柱温(25 ℃，40 ℃)、流速(±0．2 mL/min)对结果的影响。结果显示，改变流动相中有机相的量、pH、柱温、流速对结果几乎无影响，说明方法耐用性较好。

2．3．4 样品含量测定和含量限度确定

取10批样品，分别照拟订方法测定含量。结果见表2。10批含量测定结果表明，样品中甘草酸的平均含量为0．305 g/L，按80%计，为0．244 g/L，故暂订本品含量限度为每1 mL含甘草以甘草酸计，不得少于0．24 mg。

3 讨论

苦杏仁所含的苦杏仁苷为氰苷，水解后产生氢氰酸，对呼吸中枢呈镇静作用，使呼吸运动趋于安静而达到镇咳的作用，为止咳的有效成分，故对其进行鉴别[2]。由于苦杏仁苷不稳定，以其水解产物氢氰酸与三硝基苯酚试纸的显色反应对其进行鉴别。

表2 样品含量测定结果(g/L，n=10)

以文献[1]甘草含量测定项下流动相甲醇-0．2 mol/L醋酸铵-冰醋酸(63∶37∶1)进样测定，结果样品中甘草酸色谱峰与相邻杂质峰分离不好，且此流动相含缓冲盐，对色谱柱伤害较大，平衡时间较长;以文献[2]选用的乙腈-水-冰醋酸(35∶65∶2)为流动相，结果甘草酸色谱峰与相邻杂质峰分离较好，理论板数较高，保留时间适宜，故选用此流动相作为本品的流动相。

精密吸取本品3份，每份10 mL，置50 mL容量瓶中，分别加50%甲醇、稀乙醇、流动相各40 mL，超声处理15 min，放冷，分别加50%甲醇、稀乙醇、流动相稀释至刻度，摇匀、滤过、进样，测定各份样品的含量，以确定提取溶剂。结果表明，3种溶剂中流动相提取含量最低(0．18 g/L)，稀乙醇和50%甲醇提取所得含量无明显差别(0．20～0．22 g/L)。由于甲醇毒性大，从环保的角度考虑，故选择稀乙醇作为提取溶剂。

精密吸取本品3份，每份10 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇40 mL，分别超声处理10，15，25 min，放冷，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，测定各份样品的含量，以确定提取时间。结果表明，超声提取15 min即提取完全，故确定提取时间为15 min。

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