硒锌与富啡酸配施对紫花苜蓿产量、营养成分及氨基酸组成的影响

田春丽,介晓磊,刘巘,刘芳,郭孝,胡华锋,刘世亮*

(1.河南农业大学资源与环境学院,河南 郑州 450002;2.河南牧业经济学院,河南 郑州 450011;3.河南农业职业学院,河南 中牟 451450;4.黄淮学院,河南 驻马店 463000)

研究表明硒是人体和动物必需的微量营养元素，兼具营养、疾病治疗和致毒等多种生物学效应[1]。缺硒是人类克山病和大骨节病产生的主要原因，也与动物白肌病的发生密切相关，但是过量摄入硒也会导致急性或慢性中毒，致使动物胚胎畸形发育，甚至死亡或发生“碱性病”。研究表明，世界范围内的低硒区域面积远大于高硒的硒毒区面积，我国2/3的地区属于缺硒地区，29%的地区严重缺硒[2]，由此导致人、畜缺硒在我国甚至世界都较普遍。在土壤-植物-动物-人体生态链中，植物是自然界硒循环过程中的关键性环节，植物硒含量决定食物链硒水平，低硒环境势必造成低硒食物的产生，人类通过动物性食物或植物性食物消费而摄取的硒量是人体由缺硒状态向适硒状态转变的关键。因此，通过将硒引入食物链可以克服缺硒的问题。

近年来，有关硒对重要的饲料资源——牧草的影响已引起不少关注[3-4]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一种多年生优质蛋白饲草，被誉为“牧草之王”，其在生长过程中不仅需要氮磷钾等大量营养元素，而且还需要铁、锰、铜、锌、钼、硼、钴、硒等多种微量元素[5]。在河南省广泛分布的石灰性潮土中，游离的碳酸钙对硒和锌有较强的吸附和固定作用，导致土壤中硒、锌有效性极低[6]。但是关于河南低硒低锌石灰性潮土区，尤其是地方病严重地区，如何调节该地区农产品的硒、锌等微量组分营养的研究报道较少。研究表明，富含羟基、酚羟基、甲氧基、羧基等活性功能团的富啡酸(fulvic acid，FA)对微量元素离子有较强的络合或螯合能力，从而影响微量营养元素的储存、传递和吸收。Kumar和Prasad[7]研究表明，富啡酸可显著提高锌在石灰性土壤中的扩散系数，促进锌向可溶性配合物的转化，增加作物的产量和吸收量。而硒是两性元素，具有3d104s24p4电子结构，与含氧基团有较强的成键倾向，易与富啡酸络合产生低分子量的硒-富啡酸螯合物，从而提高动植物对硒的吸收[8]。为此，本试验通过在低硒低锌的石灰性潮土上基施硒锌混合微肥和富啡酸的田间试验，研究硒、锌和富啡酸对紫花苜蓿产量、品质和氨基酸组成的影响，以期为河南紫花苜蓿种植中合理施用硒、锌肥提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点为河南省农业高新科技园区。该区属于北暖温带大陆季风性气候区，日平均气温14.3℃，1月份日均温1.5℃(最低-20℃)，7月份日均温27.5℃(最高40℃)，≥10℃有效积温为4700～5000℃，平均年降雨量630 mm，无霜期220～225 d。试验区土壤为潮土，质地为轻壤土，肥力中等。土壤有机质含量为10.7 g/kg，碱解氮为55.2 mg/kg，速效磷为11.5 mg/kg，速效钾为85.0 mg/kg，有效锌0.64 mg/kg，有效硒0.008 mg/kg，pH值为7.88。

1.2 供试材料

供试紫花苜蓿为二年生第一茬收获样，品种为三得利，秋眠级数4.0。

供试肥料：氮肥为尿素[CO(NH2)2，含N 46%]；钾肥为硫酸钾(K2SO4，含K2O 50%)；磷肥为过磷酸钙(含P2O512%)；锌肥为七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O，AR)，含锌量为22.6%；硒肥为亚硒酸钠(Na2SeO3，AR)，含硒量为45.6%。

1.3 试验设计

试验采用随机区组设计，共设5个不同施肥处理，分别为：(1)仅施氮、磷、钾肥料，施肥量为，N：90 kg/hm2，P2O5：120 kg/hm2，K2O：105 kg/hm2(用NPK表示)；(2)在施用氮、磷、钾肥料的基础上增施富啡酸，氮、磷、钾肥料，施肥量同(1)，下同；富啡酸(FA)施用量为90 kg/hm2，即氮磷钾+富啡酸(用NPK+FA表示)；(3)在施用氮、磷、钾肥料的基础上增施硒锌混合微肥，硒、锌施用量分别为，ZnSO4·7H2O：15 kg/hm2(纯Zn量为3.39 kg/hm2)、Na2SeO3：0.60 kg/hm2(纯Se量为274 g/hm2)，即氮磷钾+硒锌混合微肥(用NPK+Se+Zn表示)；(4)在施用氮、磷、钾肥料的基础上增施富啡酸和锌硒混合微肥，即氮磷钾+富啡酸+硒锌混合微肥(用NPK+FA+Se+Zn表示)；(5)以不施任何肥料为对照(CK)。每个处理重复3次，小区面积为4 m×3 m，共15个小区，随机区组排列。

根据试验设计，将各小区所需氮、磷、钾、微量元素肥料和富啡酸混匀，作基肥一次性撒施于已整好的小区土壤表面并采用人工翻耕，翻耕深度为20 cm左右。

本试验于2010年9月下旬进行整地施肥，10月3号播种，播种方式为条播，行距30 cm左右，播深1.5～2.0 cm，埂宽30 cm，各区组间过道宽50 cm。播种量为15 kg/hm2，播后镇压保墒，出苗后注意补苗，生长期间按大田种植模式管理。本文数据来自紫花苜蓿第二年第一茬收获样品，采样时间为紫花苜蓿的初花期(2012年5月2日)。

1.4 基础土样的采集与测定

整地后采用“S”型多点法取0～20 cm土层样品，风干后过1 mm和0.3 mm尼龙筛，备用。基础土样理化性状测定参照鲍士旦[9]的方法；有效锌采用DTPA浸提—AAS法[9]；有效硒采用NaHCO3(pH 8.5)浸提—AAS法[10]。

1.5 植株草产量及营养成分测定

1.5.1干草产量的测定 初花期采样时，为便于计算亩产量，按照常规方法，于每试验小区中选取3行长势均匀的样点，每行1.1 m，折合为1 m2，刈割时留茬5 cm左右，刈割后立即称重，测定鲜样含水率后，按下面公式换算出每hm2干草产量。

1.5.2植株常规营养成分的测定 植株样品用去离子水清洗、杀青、烘干后粉碎过1 mm筛，备用。粗蛋白质采用浓硫酸-双氧水消化-半微量凯氏定氮法；粗脂肪采用索氏脂肪提取法；粗纤维采用酸性洗涤剂法(ADF)；粗灰分采用干灰化法；无氮浸出物(%)=100-粗蛋白质(%)-粗脂肪(%)-粗纤维(%)-粗灰分(%)[11]。植株全硒采用GB/T13883-2008法(饲料中全硒的测定)，植株全锌采用湿灰化法[9]。硒(锌)积累量按下列公式进行计算：硒(锌)积累量=硒(锌)含量×干物质

1.5.3紫花苜蓿氨基酸含量和组分的测定 准确称取粉碎过0.3 mm的样品200～500 mg于试管中，加入10 mL 6 mol/L的盐酸溶液(含0.5%巯基乙酸)进行水解，冷冻后抽真空，再充入氮气，封口，将试管放入110℃的烘箱中水解22～24 h，冷却后过滤到50 mL容量瓶中，并用无离子水稀释至刻度，过滤。准确取10 μL样品液于5 mm×50 mm小试管中，真空抽干，加入20 μL衍生缓冲液，于混合器上振荡30 s，加入20 μL衍生试剂，用封口膜封口，振荡30 s，放入60℃烘箱30 min，冷却后加入160 mL平衡缓冲液，振荡混合30 s。然后使用氨基酸自动分析仪(日立L-8800，日本)检测牧草中17种氨基酸含量。

1.6 数据处理方法

采用Excel 2013和DPS 7.05版软件进行数据处理和统计分析，并采用Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

图1 不同施肥处理对紫花苜蓿干草产量的影响Fig.1 Effects of Se-Zn and fulvic acid combined application on herbage yield of alfalfa 不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different capital letters show significant difference at P<0.01, different small letters indicate significant differences at P<0.05 by the Duncan-test. The same below.

2.1 不同施肥处理对紫花苜蓿草产量的影响

从图1可知，各施肥处理均促进了紫花苜蓿草产量的增加。与对照(CK)相比，干草产量增幅为3.25%～42.43%，不同处理干草产量大小顺序为：NPK+FA+Se+Zn>NPK+FA>NPK+Se+Zn>NPK>CK。

具体而言，以NPK+FA+Se+Zn处理产量最高，高达16.28 t/hm2，比对照(11.43 t/hm2)显著提高(P<0.01)，高出4.85 t/hm2，增幅为42.43%；其次是NPK+FA和NPK+Se+Zn处理，产量分别为14.09和13.31 t/hm2，分别比对照高2.66和1.88 t/hm2，增幅分别为23.24%和16.39%；NPK处理较对照增产仅为0.37 t/hm2，增幅为3.24%，与对照差异不显著，说明施肥能不同程度地促进紫花苜蓿干物质的累积，而仅施氮磷钾对提高紫花苜蓿草产量效果并不理想。另外，NPK+FA+Se+Zn、NPK+FA与NPK+Se+Zn三个处理之间均达到显著差异，表明在统一施氮磷钾基础上，富啡酸与硒锌混合微肥配施的增产效果最好，且富啡酸的施用比硒锌混合微肥施用的效果更明显，这可能因为富啡酸作为可溶性腐殖酸能刺激植物根系生长，提高紫花苜蓿根系活力，使紫花苜蓿对水分和养分的吸收运转加强，促进紫花苜蓿生长[12]，且富啡酸可与微量元素形成水溶性螯合物，增强微量元素的吸收和运输，进而提高植物的抗逆性和改善作物品质[13]。而在石灰性土壤中基施硒和锌的效果不如富啡酸与硒锌混合微肥配施明显，主要原因可能是大部分硒和锌被固定所致[6]，但NPK+Se+Zn处理仍与NPK处理差异显著，这与Se、Zn的生理功能有关，Zn能促进紫花苜蓿体内IAA含量增加，提高苜蓿株丛数、改善结瘤、促进分枝、增加株高从而达到增产效果[14]，而Se在一定程度上促进紫花苜蓿产量的增加。因此在紫花苜蓿的生产中，适量施用锌硒微肥或富啡酸均有利于产草量的提高。

2.2 对紫花苜蓿硒含量与积累量的影响

由表1可见，NPK+FA+Se+Zn处理紫花苜蓿硒含量为2.01 mg/kg，比对照(0.37 mg/kg)高1.64 mg/kg，增幅为448.18%，这与紫花苜蓿对硒具有较强的吸收和富集能力[15]有关；其次为NPK+Se+Zn处理，硒含量为1.81 mg/kg，比对照(0.37 mg/kg)高1.44 mg/kg，增幅为393.64%，然后为NPK+FA处理，硒含量为0.58 mg/kg，比对照(0.37 mg/kg)高0.21 mg/kg，增幅为58.18%，NPK处理紫花苜蓿硒含量为0.45 mg/kg，比对照(0.37 mg/kg)高0.08 mg/kg，增幅为21.82%。NPK+FA+Se+Zn与NPK+Se+Zn处理间达极显著差异，表明富啡酸能极显著提高土壤硒的有效性，李永华和王五一[16]研究表明，土壤中的硒能溶于富啡酸形成碱性溶液，减少施入硒的固定。NPK+Se+Zn与NPK+FA处理之间也达到极显著差异，表明在严重缺硒地区通过土壤基施硒肥能有效提高紫花苜蓿硒含量；单施氮磷钾处理也提高了紫花苜蓿硒含量。

2.3 对紫花苜蓿锌含量与积累量的影响

紫花苜蓿锌含量与硒含量的规律类似(表1)，也表现出NPK+FA+Se+Zn>NPK+Se+Zn>NPK+FA>NPK>CK的趋势，虽然NPK+FA+Se+Zn与NPK+Se+Zn处理与其他3个处理之间达到了显著差异，但两者之间差异却不显著，同时NPK+FA与NPK之间、NPK与CK之间也未达到显著差异，表明基施锌硒肥极显著提高紫花苜蓿锌含量，而氮磷钾的施用并不能提高紫花苜蓿锌含量。从表1还可得知，配施硒锌混合微肥极显著提高了硒含量，也极显著提高了锌含量，表现为硒锌间的协同作用。胡华锋等[15]通过苜蓿叶面喷施硒肥研究表明，适量施硒显著促进紫花苜蓿对锌的吸收，本研究结果也与韦东普等[17]在黑麦草(Loliummultiflorum)上施硒试验的结论一致。

硒、锌积累量与其含量和紫花苜蓿产量相关(表1)，且有相似的规律性，仍以NPK+FA+Se+Zn处理最高，其次为NPK+Se+Zn处理和NPK+FA处理，而且三者之间差异极显著，即紫花苜蓿Se、Zn含量增加和产量增加共同促进了紫花苜蓿Se和Zn的积累量。

表1 不同处理对紫花苜蓿硒、锌含量与积累量的影响Table 1 Effects of Se-Zn and fulvic acid (FA) combined application on Se, Zn content and accumulations of alfalfa

同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Different capital letters show significant difference atP<0.01, different small letters indicate significant differences atP<0.05 by the Duncan-test. The same below.

2.4 不同施肥处理对紫花苜蓿营养成分含量的影响

粗蛋白含量是反映饲草营养价值的重要指标之一。苜蓿蛋白中含有20多种氨基酸，包括人和动物所需的必需氨基酸和一些稀有氨基酸，如瓜氨酸、刀豆氨酸等，是家畜合成蛋白质的原料。一般粗蛋白含量越高，饲草料品质越好。由表2可知，NPK+FA+Se+Zn处理可显著提高粗蛋白含量，并显著高于其他处理，但NPK+FA、NPK+Se+Zn与NPK处理和CK之间差异均不显著，说明单施富啡酸或硒锌可提高苜蓿的产量，但并不能提高苜蓿的粗蛋白，而富啡酸和硒锌配施可以显著提高紫花苜蓿粗蛋白含量，从而提高紫花苜蓿品质。翁伯琦等[4]的研究也表明施硒能提高黑麦草、紫花苜蓿和圆叶决明(Chamaecristarotundifolia)等牧草粗蛋白含量。

粗脂肪是植物维持生命活动必需的储藏物质，饲草中粗脂肪含量愈高，其营养价值也愈高。从表2可见，不同施肥处理对紫花苜蓿粗脂肪含量无明显影响，这与田应兵等[3]研究结果不一致，他们的研究表明土壤施硒量低于20 mg/kg时，提高了黑麦草粗脂肪含量，但当施硒量高于20 mg/kg时，黑麦草粗脂肪含量反而降低，具体原因有待进一步研究。

粗灰分是植物体内无机营养的总和，其含量可表征矿质营养含量情况。由表2可见，NPK+FA+Se+Zn与NPK+Se+Zn处理均能极显著提高紫花苜蓿粗灰分含量，且两者之间也存在明显差异，但NPK+FA和NPK处理与CK间差异不显著。

牧草中粗纤维是草食家畜日粮的主要成分，且是家畜最主要的能量来源之一，但含量过高会影响动物的适口性，降低动物的采食率。由表2可见，各施肥处理可降低紫花苜蓿粗纤维含量，但仅有NPK+FA+Se+Zn处理与对照差异显著(P<0.01)。对于无氮浸出物，各施肥处理与对照相比差异均不明显。

总之，NPK+FA+Se+Zn处理能极显著提高紫花苜蓿粗蛋白含量和粗灰分含量，而对粗脂肪、粗灰分和无氮浸出物含量则影响不显著。

表2 不同施肥处理对紫花苜蓿营养成分含量的影响Table 2 Effects of Se-Zn and fulvic acid combined application on nutrient component of alfalfa %

2.5 不同施肥处理对紫花苜蓿氨基酸组成的影响

营养学理论认为蛋白质的营养价值与其氨基酸组成密切相关，特别是必需氨基酸的含量和比例，食物蛋白质的氨基酸组成越接近人体蛋白质的组成，其营养价值越高。紫花苜蓿氨基酸的组成比例与联合国粮农组织推荐的成人氨基酸模式基本符合[18]，所以氨基酸含量和组成是评定牧草营养价值的重要指标之一。

由表3可知，与CK相比，NPK+FA+Se+Zn和NPK+FA处理显著提高了紫花苜蓿总氨基酸含量，但NPK+Se+Zn处理的总氨基酸含量却明显降低。在测定的17种氨基酸中，NPK+FA+Se+Zn处理显著提高了其中的7种氨基酸含量，其中必需氨基酸(EAA)为缬氨酸、亮氨酸以及赖氨酸，非必需氨基酸(NEAA)为天门冬氨酸、精氨酸、组氨酸和酪氨酸，其他氨基酸含量变化不明显。

在必需氨基酸中，NPK+FA+Se+Zn处理的缬氨酸含量为1.29%，比CK提高了13.16%，NPK+Se+Zn处理的缬氨酸含量为0.98%，比CK(1.14%)降低了14.04%，NPK+FA和NPK处理的缬氨酸含量也明显降低，且两者之间差异不显著；对亮氨酸而言，NPK+FA+Se+Zn处理的含量仍为最高，达到1.57%，较对照(1.48%)提高6.08%，而NPK+Se+Zn处理的含量最低，仅为1.35%，比对照降低了8.78%；对赖氨酸而言，NPK+FA+Zn+Se处理的含量为0.99%，显著高出对照0.21%，增幅为26.92%，NPK+FA处理比CK增加8.97%，其余两处理与对照无明显差异。

在非必需氨基酸中，NPK+FA+Se+Zn处理的天门冬氨酸含量为2.19%，比对照提高了6.83%，其余处理间差异不显著；NPK+FA+Se+Zn处理也提高了精氨酸的含量，达到0.96%，比对照提高了3.23%，而NPK+Se+Zn处理精氨酸的含量却显著降低，比对照降低6.46%，NPK+FA和NPK处理与对照之间差异不显著。NPK+FA+Se+Zn处理与NPK+FA处理显著提高了组氨酸含量，含量分别为0.58%和0.54%，比对照CK(0.49%)提高了18.37%和10.20%，NPK+Se+Zn处理组氨酸含量显著低至0.44%，比对照降低了10.20%，NPK处理与对照无显著差异；对酪氨酸而言，NPK+FA+Se+Zn处理与NPK处理显著提高了其含量，增加幅度分别为17.02%和8.5%。在其余的非必需氨基酸中，与对照相比，NPK+Se+Zn处理显著降低了谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸及胱氨酸的含量，降幅分别为5.65%、6.60%、8.46%与28.57%，同时NPK+Se+Zn处理显著提高了丝氨酸的含量，比对照(0.83%)提高了10.84%。NPK+FA与NPK处理显著提高了苏氨酸的含量，提高幅度分别为11.63%和9.30%。而甘氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸在各处理之间差异不明显。

表3 不同施肥处理对紫花苜蓿氨基酸含量的影响Table 3 Effects of Se-Zn and fulvic acid combined application on alfalfa amino acids formation contents %

注： *表示必需氨基酸，EAA 为必需氨基酸总量，TAA为总氨基酸，NEAA为非必需氨基酸总量。

Note： *denotes essential amino acid, EAA: Total essential amino-acids, TAA: Total amino-acids, NEAA: Total nonessential amino-acids.

由表3还可看出，各处理紫花苜蓿总氨基酸含量在15.79%～17.83%之间，与对照相比，除NPK处理外，其余处理之间均差异显著，表现为NPK+FA+Se+Zn>NPK+FA>CK和NPK>NPK+Se+Zn处理，NPK+FA+Se+Zn处理 (17.83%)和NPK+FA处理(17.1%)分别比对照CK(16.74%)提高6.51%和2.15%(P<0.05)，但NPK+Se+Zn处理总氨基酸含量(15.79%)却有所降低，降幅为5.68%。不同处理的必需氨基酸含量在5.60%～6.55%之间，NPK+FA+Se+Zn处理最大，NPK+Se+Zn处理最小，且NPK+FA>CK>NPK。另外，EAA/TAA和EAA/NEAA这两个指标规律相似，表现为CK>NPK+FA+Se+Zn>NPK+FA>NPK+Se+Zn>NPK，且CK与NPK+FA+Se+Zn之间差异不显著，但与其他处理达到显著差异，NPK+Se+Zn与NPK之间差异也不显著，但与NPK+FA差异显著。对于NEAA/TAA而言，NPK处理达最大值64.82%，其次为NPK+Se+Zn处理 (64.53%)，且两者之间无明显差异，但与NPK+FA处理(63.71%)差异显著，NPK+FA+Se+Zn处理 (63.29%)虽略低于对照(63.31%)，但两者之间差异不显著。

总之，NPK+FA+Se+Zn和NPK+FA处理能显著提高总氨基酸的含量，NPK+FA+Se+Zn处理显著提高了缬氨酸、亮氨酸以及赖氨酸这3种必需氨基酸含量，同时提高了天门冬氨酸、精氨酸、组氨酸和酪氨酸这4种非必需氨基酸含量，而NPK+Se+Zn处理显著降低了谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、胱氨酸及总氨基酸含量和必需氨基酸含量，却显著提高了丝氨酸的含量。

另外，不同处理中含量较高的6种氨基酸的含量由高到低的排列次序基本相同，都是谷氨酸>天门冬氨酸>亮氨酸>丙氨酸>甘氨酸>脯氨酸；而含量最低的4种氨基酸基本上都是胱氨酸<蛋氨酸<酪氨酸<组氨酸，此结果与王照兰等[19]的研究结论基本一致。

3 讨论

3.1 硒锌与富啡酸配施对紫花苜蓿草产量及营养成分含量的影响

近年来，随着我国畜牧业的快速发展及人们膳食结构的调整，粮食消耗量逐步下滑，而饲料为主的间接消费则急剧上升，意味着饲料的需要量急剧增加，专家预测在未来的15年及相当长的时期饲料危机将严重威胁我国食物安全[20]，优质饲料紫花苜蓿将成为不可替代的战略性保障饲草。微量元素在紫花苜蓿体内含量虽然很少，但在新陈代谢过程中起着转运物质和交换能量的作用，当牧草缺乏某种微量元素时，生长发育都会受到抑制，导致产量和品质下降，严重时甚至死亡。单独施硒或锌对作物生理特性及品质的研究较多[3-4]，有关锌、硒相互作用虽有一些报道，但由于试验条件差异，其作用的机制尚不明确。施用硒肥不仅影响作物对硒的吸收，还不同程度地影响作物对其他矿质元素的吸收，进而影响作物的产量和品质。如Singh和Singh[21]研究发现施硒降低了小麦(Triticumaestivum)和向日葵(Helianthusannuus)体内铁、锰、铜、锌的含量，尤其是硒对于锌的拮抗作用明显；并且还发现硒对微量元素的拮抗作用因施用磷肥而改变：不施磷或磷水平较低时，硒水平的提高可降低植株锌和铜含量；而施磷量提高时，施硒肥明显增加了植株锌、铜和锰含量。据报道硒对植物生长发育的影响呈现出Bertrand生物剂量规律，即低浓度硒促进植物生长，过量则对植物生长产生毒害[7]，因此，硒只有在适度的情况下才促进作物对其他元素的吸收。本研究认为，硒锌混合微肥与富啡酸配施显著提高紫花苜蓿草产量及其锌、硒含量和积累量，富啡酸的施用显著提高硒、锌的吸收量，并通过促进根系发育、增强根系活力及提高多种合成酶活性和叶绿素含量使光合作用加强，从而显著提高紫花苜蓿的产草量及品质[22]，硒与锌表现为协同作用，这与胡华锋等[15]研究结果一致：施硒可显著促进紫花苜蓿对锌的吸收，且紫花苜蓿对锌的吸收能力与施硒量有关，当硒肥用量超过100 mg/kg时，紫花苜蓿对锌的吸收能力显著下降，表现为硒对锌的协同作用减弱，但喷施锌肥显著降低了紫花苜蓿硒的含量和吸收量[23]。韦东普等[17]研究也证实硒、锌的交互作用与硒锌肥用量有关。值得注意的是，对豆科作物紫花苜蓿是否施氮肥和施多少的问题，一直以来存在着争论。紫花苜蓿根瘤菌对空气游离N2的固定能力很强，据估算，当年生紫花苜蓿固定到土壤中的N约35～305 kg/hm2，通过生物固氮作用一般能满足自身氮的需求，因此不少学者认为紫花苜蓿无需施用氮肥，或在苗期根瘤形成前施少量氮肥即可[24]。本研究结果表明，NPK处理的紫花苜蓿干草产量虽较对照有所增加，但二者差异并不显著，表明对二年生苜蓿而言，播种时随底肥施入的氮肥对紫花苜蓿产量没有显著影响。

硒、锌不仅影响紫花苜蓿矿质营养元素的含量和吸收量，也影响常规营养成分。郭孝等[25]研究表明随着硒肥基施量的增加，裸燕麦(Avena)秸秆中粗蛋白和无氮浸出物的含量呈下降趋势，而粗灰分、粗脂肪以及粗纤维的含量呈上升的趋势；硒肥对裸燕麦果实在基施量小的情况下(570～765 g/hm2)能显著提高果实中的粗蛋白质含量，降低粗纤维的含量，当超过这个范围则可显著提高粗脂肪和粗纤维的含量，但对粗蛋白质含量无显著影响。本研究表明，富啡酸与硒、锌配施处理能极显著提高紫花苜蓿粗蛋白含量和粗灰分含量，而对粗脂肪、粗灰分和无氮浸出物含量影响不显著。这与胡华锋等[15]的研究结果有一定差异，他的研究表明适量施用硒能显著提高紫花苜蓿粗蛋白、粗灰分、粗脂肪的含量，降低粗纤维含量。这可能与硒、锌等施用方式不同有关，他们采用的是叶面喷施方式，而本试验采用的是土壤基施的方式，硒、锌的固定相对比较严重。但总体可以看出，硒对不同作物的品质指标影响不尽一致，其内部作用机理还需进一步研究和探讨。

3.2 硒锌与富啡酸配施对紫花苜蓿氨基酸组成的影响

牧草中氨基酸含量的高低、组成种类以及比例直接影响牧草最终品质以及对家畜的生长。必需氨基酸是指动物机体需要但本身不能合成，必须从饲草料中摄取的氨基酸；不同动物机体需要的必需氨基酸种类存在差异。当必需氨基酸以动物所需的比例吸收时，动物对总氨基酸的需要量将降低，蛋白质的合成率将最大。本试验条件下，硒、锌与富啡酸配施显著提高了缬氨酸、亮氨酸以及赖氨酸等3种必需氨基酸(EAA)的含量，同时提高了非必需氨基酸(NEAA)中的天门冬氨酸、精氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量，其他氨基酸变化不明显。目前认为，硒至少以两种方式参与蛋白质的代谢，一是以无机硒的形态进入植物体后很快转化为Se-Cys(硒代半胱氨酸)、Se-Met(硒代蛋氨酸)、Cy-Se(硒代胱氨酸)等多种氨基酸，以原料形式直接参与蛋白质的合成，从而减少了游离氨基酸中半胱氨酸、蛋氨酸的含量；二是硒可能是植物体内一种tRNA 核糖核酸链的必要组分，现已证实植物体内确实存在具有硒代半胱氨酸残基的tRNA，其主要的生理功能是转运氨基酸用于蛋白质的合成。因硒元素与硫元素的化学性质相似，在黑麦草和紫花苜蓿中也都观察到了硒对含硫氨基酸中硫的广泛取代，尽管对其体内其他形态的硒尚欠了解，但可以认为黑麦草体内的硒大都以氨基酸的形式被结合于植物蛋白质[3]。周遗品[26]研究表明，适量施用硒肥，促进了水稻(Oryzasativa)籽粒中蛋白质和大多数氨基酸含量增加，其中以土壤基施硒量为2 mg/kg时效果最为显著，蛋白质含量和氨基酸总量分别比对照增加15.0%和18.1%；17种氨基酸除含硫氨基酸(胱氨酸和蛋氨酸)含量受硒的影响减少外，其余15 种氨基酸含量均明显增加，最高增长率为32%。但本试验中，施硒处理紫花苜蓿的含硫氨基酸蛋氨酸及半胱氨酸的含量与不施硒处理间差异不显著，可能由于本试验中硒、锌的用量较低，加上土壤对之大量固定和吸附，使得在苜蓿体内硒与硫表现出拮抗作用[27]，具体原因有待进一步研究。

硒能提高牧草和籽粒中氨基酸的总含量，可能与氨基酸的密切结合有关，植物吸收的硒能以化合物(包括游离Se)的形式存在于生物体内，并以硒代氨基酸形式结合于蛋白质中。李明等[28]研究表明，基施硒肥可以提高莜麦(Avenanuda)籽粒中蛋氨酸、亮氨酸以及赖氨酸等3种必需氨基酸的含量，并显著提高天门冬氨基酸、谷氨酸、丝氨酸和甘氨酸等非必需氨基酸的含量，同时，提高了氨基酸的总含量，但对氨基酸中必需氨基酸/总氨基酸(EAA/TAA)、非必需氨基酸/总氨基酸(NEAA/TAA)和必需氨基酸/非必需氨基酸(EAA/NEAA)等指标影响不大，这与本试验的结论一致。值得注意的是，本研究中NPK+Se+Zn处理与其他处理截然不同，该处理显著降低了谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、胱氨酸及总氨基酸含量和必需氨基酸含量，但显著提高了丝氨酸的含量，这可能与苜蓿品种、施肥方式、土壤环境条件等有关，具体原因有待深入研究。由于植物体内不同形态的硒化合物对人和动物的作用差异较大，因此，比较苜蓿对不同形态硒的吸收利用以及其在体内的转化和存在形态值得进一步研究和探讨。近年来，随着对含硒生物大分子研究的不断深入，更清楚地了解植物中含硒化合物的分子形态、作用机理和功能，并从分子水平阐明硒同人类健康与疾病的密切关系具有重要意义，而硒在作物体内的功能和表达机理尚不十分清楚。研究者认为硒元素以SeO42-或者SeO32-的形式被植物吸收后，主要转运到叶绿体中[29]。但是硒被转运到叶绿体之后，作用于什么位点，发挥什么功能，通过怎样的方式影响植物的光合作用和其他生理功能，值得进一步探索，而质谱鉴定等蛋白质组学研究手段为揭示外源硒影响植物光合作用和生理功能的本质规律和机制提供了可能。目前，国内外从蛋白组学水平分析紫花苜蓿响应重金属胁迫途径中的差异研究尚不多见，而深入阐明植物解毒及积累重金属的机制并揭示其对植物生命活动规律及重要生理、病理现象将成为今后一阶段的研究重点。另外，虽然现在研究了不少参与重金属的吸收、转运和调控过程的基因，但是这些基因是怎样协同工作，又是通过哪些机制来调控，还知之甚少，这将是重金属在植物体内转运机理研究的一大发展趋势[30]。相信随着大量新技术的开发应用，蛋白质组学研究将会在植物生长、发育、进化及代谢调控等生命活动的规律等方面取得重大突破。

4 结论

在统一施用氮磷钾基础上，适量硒锌或富啡酸均可提高紫花苜蓿干草产量，且以两者配施(NPK+FA+Se+Zn)效果最好，产量达16.28 t/hm2，比对照(11.43 t/hm2)显著(P<0.01)高4.85 t/hm2，增幅为42.43%，NPK+FA和NPK+Se+Zn处理较对照增幅分别为23.24%和16.39%，即施用富啡酸比硒锌混合微肥效果更显著。硒锌混合微肥或富啡酸均可显著提高紫花苜蓿硒、锌含量及积累量；其中以两者配施(NPK+FA+Se+Zn)紫花苜蓿硒、锌的含量和积累量达到最高值，表明通过适量施用硒锌混合微肥可明显提高紫花苜蓿对锌硒的吸收，而富啡酸的配施促进了紫花苜蓿对硒锌的吸收。硒锌和富啡酸配施极显著提高了紫花苜蓿粗蛋白含量和粗灰分含量，而对粗脂肪、粗纤维和无氮浸出物含量影响不显著，也为提高紫花苜蓿品质打下基础。硒锌和富啡酸配施处理显著提高了氨基酸总量及缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)以及赖氨酸(Lys)等3种必需氨基酸(EAA)，同时提高了非必需氨基酸(NEAA)中的天门冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)和酪氨酸(Tyr)，其他氨基酸变化不明显。因此，适量硒锌与富啡酸配施有利于增加苜蓿干草产量、营养成分和必需氨基酸含量和氨基酸总量，进而改善紫花苜蓿品质。