抗人胸腺细胞免疫球蛋白与抗人T淋巴细胞免疫球蛋白体外淋巴细胞杀伤效价的比较

王筱啸，王军祥，赵 越，李迎坤，陈 刚

(华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所，湖北 武汉 430032)

在移植前或移植后早期，使用针对T淋巴细胞的多克隆抗体诱导治疗可以成功减少急性排斥发生率及与移植相关的患者死亡率［1］。依据免疫原和免疫动物物种的不同，可分为不同的多克隆抗体。抗胸腺细胞免疫球蛋白(anti thymocyte immunoglobulins，ATGs)是由人的胸腺细胞免疫马或者兔而得到的多克隆抗体。临床使用中发现兔抗来源的ATGs效果更好。目前，抗人胸腺细胞免疫球蛋白(anti-human thymocyte immunoglobulin，ATG)是临床广泛应用的兔抗人ATGs，用于免疫诱导和急性排斥反应的治疗。近来德国费森尤斯公司生产的抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(anti-human T-lymphocyte immunoglobulins，ALG)也已在国内上市。ALG是以人白血病T细胞株Jurkat细胞系的T淋巴细胞作为免疫抗原进行制备的兔抗人T细胞免疫球蛋白。ATG和ALG制备过程及药物剂量均不同，ATG为5 mg/ml×5 ml/瓶，ALG 为 20 mg/ml×5 ml/瓶。杀伤淋巴细胞的效价也未见报道。二者临床应用的剂量仍存在争论。本文通过对正常受试者外周血淋巴细胞体外淋巴毒试验和流式细胞术比较两种ATGs杀伤淋巴细胞的效价，以期对临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 ATG:兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白，5 mg/ml×5 ml/瓶，法国赛达药厂。ALG:兔抗人T淋巴细胞免疫球蛋白，20 mg/ml×5 ml/瓶，德国费森尤斯公司。淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物科技制品有限公司。

1.2 主要实验仪器 超净工作台(苏州安泰公司);倒置显微镜(Olympus公司);恒温水浴箱(北京长风医疗器械有限公司手术器械厂);台式高速离心机(德国EPPENDORF公司);流式细胞仪(BD公司，FACSCalibur)。

1.3 方法 ①人外周血淋巴细胞分离:健康志愿者6名(男5名，女1名，年龄25～28岁)，抗凝管分别采集6人外周血各10 ml。密度梯度离心法收集淋巴细胞并调整浓度至0.6×106/ml备用。②体外淋巴细胞毒试验(CDC):ALG原液1∶4稀释至与ATG相同浓度(5 mg/ml)，将相同浓度的ATG与ALG倍比稀释为1∶1至1∶512。取各滴度ATG和ALG每管50 μl加入250 μl淋巴细胞混匀，4℃孵育50 min。每管加入兔补体50 μl混匀，37℃孵育30 min。每管加入7 μl PI避光孵育15 min。流式细胞仪检测淋巴细胞死亡率。以上各步骤间均需流式缓冲液洗1次，1500 rpm×5 min。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验;计数资料比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATG和ALG对人外周血淋巴细胞的杀伤作用 图1a显示滴度为1∶16时淋巴细胞杀伤，R1区域为淋巴细胞圈门，可见门内细胞明显分为左右两群，左群为被ATG杀伤淋巴细胞，右群为存活淋巴细胞。图1b为图1a的直方图显示，可见左右两个峰，左侧为存活淋巴细胞，M1为PI染色的死亡淋巴细胞，可见此滴度下淋巴细胞杀伤比率为51.39%。图1c根据不同滴度杀伤淋巴细胞比率做成折线图，可见杀伤淋巴细胞比率随着稀释滴度增加而减低。但在绝大多数滴度ATG杀伤均高于ALG，其余杀伤曲线也有相同的趋势。体外淋巴毒试验中ATG对6名健康志愿者外周血淋巴细胞具有明显杀伤作用。图1c、图2a显示滴度为1:1时杀伤淋巴细胞比率最高为54.06% ～82.49%［(66.24±10.35)%］。随着稀释滴度的增加，杀伤比率逐渐下降，在 1∶128时杀伤比率＜10%［(5.59±2.59)%］，可以认为此滴度下ATG对淋巴细胞已无明显杀伤作用。

2.2 ALG对人外周血淋巴细胞的杀伤作用 体外淋巴毒试验中ALG对外周血淋巴细胞也具有较强的杀伤作用。图1c、图2a显示与ATG相似，滴度为1∶1时杀伤效果最强为38.06% ～70.38%［(59.8±11.8)%］。随着稀释滴度的增加，杀伤效果逐渐下降，在 1∶64时杀伤比率＜10%［(6.31±4.80)%］。

2.3 ATG和ALG杀伤淋巴细胞效价的比较 图2a显示，以淋巴细胞细胞杀伤比率10%为转阴点，可见ATG杀伤淋巴细胞平均转阴滴度为1∶128，ALG转阴滴度为1∶64。ATG和ALG对于相同滴度下各组淋巴细胞杀伤差异有统计学意义(P=0.006)。为更直观的比较两者，将图2a中的ALG曲线依次后移，即ALG 1∶1对应ATG 1∶2，依次类推得到图2b。两条曲线趋势一致，几乎贴合。此时ATG和ALG对于相同滴度下各组淋巴细胞杀伤差异无统计学意义(P=0.93)，可以认为各滴度ATGF与低于其浓度一倍的ATG杀伤淋巴细胞的效价相同。即相同浓度下ATG杀伤效价大约是ALG的2倍。

图1 a:散点图展示淋巴细胞杀伤;b:直方图显示淋巴细胞杀伤;c:根据不同滴度杀伤淋巴细胞比较率成折线图

图2 ATG和ALG对6名志愿者淋巴细胞杀伤的比较

2.4 ATG和ALG杀伤T、B淋巴细胞的比较 分别用FITC和APC标记T/B淋巴细胞，研究两种ATGs对淋巴细胞亚群的杀伤。图3显示滴度1∶16时ATG和ALG杀伤CD19+B和CD3+T淋巴细胞的比例。此滴度下ATG杀伤B淋巴细胞百分比为48.6%，明显高于ALG的37.2%。ATG杀伤T淋巴细胞百分比为64.7%，亦高于ALG的55.4%。综合所有志愿者杀伤淋巴细胞亚群的比例ATG和ALG对外周血T淋巴细胞杀伤差异无统计学意义［(51.23±14.03%)vs(49.84±5.82)%，P=0.81］，两者对B淋巴细胞杀伤差异有统计学意义［(40.45±13.02)%vs(24.31±9.67)%，P=0.03］。可以认为ATG和ALG杀伤T淋巴细胞效果相同，但ATG杀伤B淋巴细胞强于ALG。

3 讨论

抗淋巴细胞制剂自1960年起便应用于肾移植［2］。ATG和ALG是目前临床应用较为广泛两种抗淋巴细胞免疫球蛋白。二者均是兔抗人制剂，但制备过程略有不同。ATG是以人的胸腺细胞作免疫抗原注入新西兰兔体内，进行纯化和消毒后得到的多克隆抗体。ALG则是以人工培养分离的人白血病T细胞株Jurkat细胞系的T淋巴细胞作为免疫抗原进行制备［4，5］。为了比较 ATG和ALG杀伤淋巴细胞的效价，我们在体外淋巴毒试验中，将ATG和ALG分别进行倍比稀释。并将两者杀伤同一患者同一滴度下的淋巴细胞数据进行比较，差异有统计学意义(P=0.006)。说明相同滴度下两种ATGs杀伤淋巴细胞的效价并不相同。而将1∶1稀释的ATG-F与1∶2稀释的ATG进行配对(以此类推至1∶512稀释的ATG-F与1∶256的ATG配对)，差异无统计学意义(P=0.933)，说明ATG-F与低于其浓度一倍的ATG杀伤淋巴细胞的效价相同。再结合多个单独的个例，ATG转阴均较ATG-F延迟一个滴度。ALG平均在滴度1∶64转阴，而ATG是1∶128。我们推断ATG杀伤淋巴细胞效价大约是ALG的两倍。进行淋巴细胞分群，ATG对T/B淋巴细胞均有显著杀伤作用。ALG对T淋巴细胞杀伤明显，但对B淋巴细胞杀伤弱于ATG。不同的制备过程作为一种潜在的因素决定了两种ATG对特异性淋巴细胞抗原的不同免疫抑制活性。此外我们还发现体外淋巴毒试验中，ATG和ALG杀伤淋巴细胞存在明显的个体差异。在6名志愿者中，ATG杀伤淋巴细胞比率最大可达82.49%，最小为54.06%。ALG最大为70.38%，最小为38.06%。

图3 滴度为1∶16的ATG和ALG杀伤同一志愿者CD19+B和CD3+T淋巴细胞比例

综上所述，本实验证明ATG和ALG均可显著清除正常人外周血淋巴细胞，但个体差异较大。相同浓度下，ATG的效价大约是ALG的2倍。此外，ATG比ALG有更强的清除B细胞的作用。这些结果将对临床选择ATGs的种类和适宜的剂量提供依据。

［1］Padiyar A，Augustine JJ，Hricik DE.Induction antibody therapy in kidney transplantation［J］.Am J Kidney Dis，2009，54(5):935-944.

［2］Starzl TE，Marchioro TL，Porter KA，et al.The use of heterologous antilymphoid agents in canine renal and liver homotransplantation and in human renal homotransplantation［J］.Surg Gynecol Obstet，1967，124(2):301-308.

［3］Gharekhani A，Entezari-Maleki T，Dashti-Khavidaki S，et al.A review on comparing two commonly used rabbit anti-thymocyte globulins as induction therapy in solid organ transplantation［J］.Expert Opin Biol Ther，2013，13(9):1299-1313.

［4］Leitner J，Grabmeier-Pfistershammer K，Majdic O，et al.Interaction of antithymocyte globulins with dendritic cell antigens［J］.Am J Transplant，2011，11(1):138-145.

［5］Zuckermann AO，Grimm M，Czerny M，et al.Improved long-term results with ATG induction therapy after cardiac transplantation:a comparison of two different rabbit-antithymocyte globulines［J］.Transplantation，2000，69(9):1890-1898.

［6］Urbanova M，Brabcova I，Girmanova E，et al.Differential regulation of the nuclear factor-kappaB pathway by rabbit antithymocyte globulins in kidney transplantation［J］.Transplantation，2012，93(6):589-596.

［7］Ankersmit HJ，Roth GA，Moser B，et al.CD32-mediated platelet aggregation in vitro by anti-thymocyte globulin:implication of therapyinduced in vivo thrombocytopenia［J］.Am J Transplant，2003，3(6):754-759.

［8］Monti P，Allavena P，Di Carlo V，et al.Effects of anti-lymphocytes and anti-thymocytes globulin on human dendritic cells［J］.Int Immunopharmacol，2003，3(2):189-196.

［9］Zand MS，Vo T，Huggins J，et al.Polyclonal rabbit antithymocyte globulin triggers B-cell and plasma cell apoptosis by multiple pathways［J］.Transplantation，2005，79(11):1507-1515.