芙蓉叶粉的灭菌工艺研究

朱 倩，付文焕，李近磊，张惠清，李中东

(复旦大学附属华山医院，上海 200040)

复方芙蓉叶糊 (曾用名:三圣散)为复旦大学附属华山医院特色外用制剂，由芙蓉叶、赤小豆组方而成，功能主治解毒排脓，用于消炎消肿［1-2］。临床应用30余年，效果良好。该制剂主要原料为中药材原粉，且辅料为麦芽糖，制备成糊剂后很难再对其进行常规灭菌，细菌数、霉菌酵母菌数均难以控制，成品制剂的微生物限度检验结果很难达到《中国药典》2010年版要求。因此考虑在制剂制备前，对原料中的中药原粉进行灭菌处理后再制成制剂，严格控制制剂制备环境，以使成品制剂达到微生物限度要求。芙蓉叶粉为本制剂主要原料，且为制剂的主要药用成分。本实验通过对芙蓉叶粉进行热压灭菌、60钴辐射灭菌和低温间歇灭菌，考察原料灭菌后的性状、主要成分含有量及灭菌效果，确定该原料的最佳灭菌工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪，Dikama C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);Sartorius BL150 电子天平，YXQ-LS-50S II型立式压力蒸汽灭菌器;DHG-9426电热恒温鼓风干燥箱，60钴射线源由中国科学院上海辐照中心提供。

1.2 试药 芙蓉叶粉 (上海市虹桥饮片厂);芦丁对照品(批号100080-200707，中国药品生物制品检定所);槲皮素对照品 (批号100081-200406，中国食品药品检定研究院)。

1.3 培养基 营养琼脂培养基 (批号20101218)、玫瑰红钠琼脂培养基 (批号20101121)、蛋白胨水培养基 (批号20101130)、胆盐乳糖培养基 (批号20101207)、营养肉汤培养基 (批号20101211)、甘露醇氯化钠琼脂平板(20101208)、溴化十六烷基三甲铵琼脂平板 (批号20101208)，均购自上海盛思生化科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 灭菌方法

2.1.1 热压灭菌法［3］将20 g芙蓉叶粉称入干燥灭菌试管中，密封。置压力蒸汽灭菌器中，121℃下，灭菌30 min。

2.1.260钴辐射灭菌法［4-5］将20 g芙蓉叶粉称入干燥灭菌试管中，密封。在中国科学院上海辐照中心进行60钴辐射灭菌，辐照强度6 kGy。

2.1.3 低温间歇灭菌法［6-7］将5 g芙蓉叶粉称入直径90 mm有盖灭菌培养皿中，置电热恒温鼓风干燥箱中，60℃恒温1 h后，于25℃保持24 h，记为灭菌1次;同法在60℃下分别灭菌2次、3次和4次。依上述方法同法操作，于70℃与80℃下分别各灭菌2次、3次、4次。

2.2 微生物限度检查［8-9］对原粉及上述3种方法灭菌后的样品，按《中国药典》微生物限度检查法，进行微生物限度检查。按芙蓉叶原料占原制剂处方百分比16%，换算细菌数与霉菌数。灭菌前后原料性状及微生物限度检查结果见表1。

表1 芙蓉叶粉不同灭菌方法微生物限度检查结果 (n=3)

2.3 定量测定［10-12］

2.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品适量，用60%乙醇溶解后配制成含芦丁105.6 μg/mL、槲皮素105.4 μg/mL的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取芙蓉叶粉末 (过80目筛)2 g，于100 mL锥形瓶中，加入60 mL 60%乙醇溶液，称定质量，超声提取3 h，冷却后用60%乙醇溶液补足质量。经0.45 μm的滤膜滤过，取续滤液供 HPLC测定用。

2.3.3 色谱条件 Dikama C18色谱柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液洗脱 (45∶55)，体积流量1 mL/min，柱温35℃，检测波长350 nm。在该色谱条件下，芦丁、槲皮素分离良好。色谱图见图1～2。

图1 芦丁、槲皮素对照品HPLC图谱

图2 芙蓉叶粉供试品HPLC色谱图

2.3.4 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液2、5、10、15、20 μL。依照上述色谱条件测定芦丁及槲皮素峰面积，以峰面积为Y，进样量为X，进行线性回归分析，得芦丁、槲皮素的回归方程分别为:Y芦丁=1468327X+24468，r=0.9994;Y槲皮素=2992329X － 123978，r=0.9993。结果表明，芦丁、槲皮素分别在0.2112～2.112 μg、0.2108～2.108 μg间呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 对同一份芙蓉叶样品平行测定5次，芦丁、槲皮素的RSD分别为2.3%、3.5%(n=5)。

2.3.6 重复性试验 精密称同一份芙蓉叶样品5份，按上述方法制备供试品溶液，参照上述色谱条件，分别测定芦丁、槲皮素的重复性RSD分别为4.26%、3.66%(n=5)。

2.3.7 回收率试验 精密称取已知含有量的芙蓉叶药材粉末9份，每份2 g，按样品含芦丁、槲皮素的50%精密加入芦丁、槲皮素对照品溶液，按相同方法制备供试品溶液，进样量10 μL。结果芦丁、槲皮素的回收率分别为97% ～104%，93%～98%;精密度 (RSD)分别为1.7%～2.0%、1.5% ～2.7%(n=3)。

2.3.8 供试品溶液稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h测定芦丁、槲皮素，其RSD分别为2.1%、4.2%(n=5)，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.9 样品的测定 分别取不同灭菌工艺处理后的芙蓉叶药材粉末，参照上述方法制备供试品溶液、按相同的色谱条件进行含量测定。结果见表2。

表2 不同灭菌方法对芙蓉叶粉中芦丁及槲皮素的影响 (n=3)

3 讨论

3.1 微生物检查及定量测定结果显示，经过3种方法灭菌后，芙蓉叶药材能够符合药典微生物限度标准的为热压灭菌法、60钴辐射灭菌法及低温间歇灭菌法80℃下4次灭菌。对这3种灭菌后的芙蓉叶粉中芦丁槲皮素进行测定，表2结果显示，芙蓉叶主要的黄酮类成分在低温间歇灭菌法前后差异不大;热压灭菌法及60钴辐射灭菌法对芙蓉叶中芦丁及槲皮素的含有量有影响。

3.2 本研究中发现，经热压灭菌后，芙蓉叶粉的性状有明显改变，粉末颜色发生变化，且有结块现象，并且在放置冷却过程中粉末容易吸潮不利于下一步的制剂生产，故该药材粉末不适用于热压灭菌法。

3.3 上述试验结果表明，通过60钴辐射灭菌，芙蓉叶粉中主要成分含有量发生变化。使用经60钴辐射灭菌的芙蓉叶粉制备芙蓉叶糊剂的过程中，在原处方比例条件下难以成形。辐照灭菌技术与传统的蒸汽压力消毒灭菌、化学及过滤灭菌法相比，辐照灭菌法可在常温下消毒灭菌而不破坏易挥发成分及热敏性物质，穿透力强，消毒均匀快速，操作简单等优点，但是对芙蓉叶进行辐照灭菌，会破坏其成分［13-14］。这提示我们在选择辐射灭菌法对中药材进行处理时需要注意进行充分考察验证。

综上所述，低温间歇灭菌法可作为芙蓉叶粉控制微生物限度的灭菌方法。该方法操作不需要特殊设备，操作简便、安全、快捷，药品质量稳定，成本低，可用于复方芙蓉叶糊中芙蓉叶粉药材的灭菌。同时本研究为一些不耐高温高压、湿热的中药原料灭菌提供了参考。

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