响应面分析法优化慢性湿疹搽剂提取工艺

易东阳，李勇华

(重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120)

慢性湿疹搽剂由苦参、红活麻、蜂房、枯矾、生地、赤芍、牡丹皮、白鲜皮、蒺藜、蛇床子等10味中药组成，具有养血凉血、滋阴润燥、祛风止痒之效，主治血虚风燥型慢性湿疹。该制剂在重庆三峡医药高等专科学校附属医院临床使用已有10余年，疗效明显，且无明显不良反应。传统一直依据经验对处方中的苦参、红活麻、生地、赤芍、牡丹皮、白鲜皮等药材进行煎煮提取，为对提取工艺进行系统研究，本实验采用响应面分析法［1-7］，对慢性湿疹搽剂提取工艺参数进行优化。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，包括Alltech Model 428 HPLC Pump，Alltech UVIS 201型紫外检测器，HT-230A型柱恒温箱，Chromatography Data System色谱工作站 (美国奥泰公司)，色谱柱 Penomenex C18柱 (250 mm ×4.8 mm，5 μm)。AUW-120D型电子天平，(日本岛津制作所株式会社)。

苦参 (Sophorae Flavescentis Radix)、蜂房 (Vespae Nidus)、枯矾 (Alumen)、生地 (Rehmanniae Radix)、赤芍(Paeoniae Radix Rubra)、牡丹皮 (Moutan Cortex)、白鲜皮(Dictamni Cortex)、蒺藜 (Fructus Tribuli)、蛇床子 (Cnidhi Fructus)等药材均购自重庆市万州区国药集团，由重庆三峡医药高等专科学校胡玉彬副教授鉴定，药材质量符合《中国药典》2010年版规定;红活麻购自重庆市储奇门药材市场，经重庆三峡医药高等专科学校胡玉彬副教授鉴定为荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻Laportea bulbifera(Sieb.et Zucc.)Wedd.的干燥根;苦参碱对照品 (批号110805-200508，中国食品药品检定研究院);试剂均为分析纯。

2 试验方法与结果

测定不同提取方法所得样品溶液的固体得率和苦参碱的量，分别乘以一定权重系数，采用综合评分作为提取工艺的考察指标。

2.1 苦参碱的测定［8-12］

2.1.1 色谱条件 以氨基键合硅胶为填充剂;以0.0085 mol/L的醋酸铵甲醇溶液 (V甲醇∶V水=9∶1)为流动相;检测波长为220 nm。理论板数按氧化苦参碱峰计算应不低于3500。

2.1.2 溶液的制备

2.1.2.1 样品提取溶液的制备 按处方比例以一剂的处方量称取各药材，按一定的加水量、提取次数、每次提取时间进行提取、过滤，滤液浓缩至60 mL。

2.1.2.2 供试品溶液的制备 精密量取上述样品溶液10 mL，加水10 mL，用浓氨试液调节至pH9～10，置分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，每次20 mL，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，残渣加甲醇20 mL溶解，滤过，精密量取续滤液10 mL，加在中性氧化铝柱 (100～200目，5 g，内径1 cm)上，依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (7∶3)混合溶液各20 mL洗脱，合并收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转移至10 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.2.3 对照品溶液的制备 取苦参碱对照品适量，精密称定，加乙腈-无水乙醇 (80∶20)混合溶液分别制成每1 mL含苦参碱50 μg的溶液，即得。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密称取苦参碱对照品7.92 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈-无水乙醇 (80∶20)混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液 (316.8 μg/mL);精密量取对照品溶液贮备液适量，分别加乙腈-无水乙醇 (80∶20)混合溶液稀释制成每1 mL中含苦参碱为23.76、47.52、95.04、190.08、380.16 μg/mL 的标准溶液，在上述色谱条件下，分别测定不同质量浓度的苦参碱对照品溶液，以峰面积A为纵坐标，进样质量浓度C为横坐标进行线性回归，得回归方程为A=20817C+27115(r=0.9999)，苦参碱溶液在23.76～380.16 μg/mL的质量浓度范围内，其峰面积与测定质量浓度呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 取苦参碱对照品溶液，重复进样6次，测定并记录其峰面积，计算RSD为0.33%，表明精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8 h进样，测定并记录其峰面积，计算RSD为0.19%，说明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取同一批号提取液，照“2.1.2”项供试品溶液的制备项下平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，并记录其峰面积，计算测定结果的RSD为0.46%，表明重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 取已知苦参碱含有量的样品6份，加入相应对照品溶液适量，制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，并记录其峰面积，结果苦参碱平均回收率102.2%，RSD为1.96%。说明该方法可行。

2.1.8 苦参碱的测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定，计算，即得。

2.2 提取液固体得率的测定 精密吸取“2.1.2”项下样品提取溶液20 mL，置蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒定质量，计算，即得。

2.3 考察指标的确定［13-16］将苦参碱的质量浓度 (Y1:mg/mL)与固体得率 (Y2:g/mL)分别以不同权重进行处理，按公式Y=0.7 Y1+0.3Y2计算，得综合评分作为考察指标。

2.4 单因素考察

2.4.1 提取时间对考察指标的影响 按处方比例称取药材，分别选定提取时间为30、60、90、120、180 min，设定加水量为药材质量的8倍，提取次数为2次，提取样品(每组3份)，按供试品溶液的制备方法，制备1～5组供试品溶液，计算固体得率，按苦参碱的测定方法进行测定，考察不同提取时间对固体得率和苦参碱量的影响，按“2.3”项下计算综合评分，结果分别为0.112、0.165、0.173、0.181、0.180，提取时间为120 min时，固体得率与苦参碱的综合得分最高，180 min之后随着时间的加长反而有点下降，可能与煎煮时间过长有一定影响。

2.4.2 加水量对考察指标的影响 按处方比例称取药材，分别选定加水量为药材量的5、8、10、15、20倍，设定提取时间为60 min，提取次数为2次，提取样品 (每组3份)，按供试品溶液的制备方法，制备1～5组供试品溶液，计算固体得率，按“2.3”项下计算综合评分，按苦参碱的测定方法进行测定，考察不同加水量对固体得率和苦参碱量的影响，按“2.3”项下计算综合评分，结果分别为0.136、0.166、0.179、0.181、0.182。当加水量为药材量的20倍，固体得率与苦参碱的综合得分最高，但药材加水量达到药材量的10倍以后，继续加大加水量对固体得率与苦参碱的综合得分无显著影响。

2.4.3 煎煮次数对考察指标的影响 按处方比例称取药材，分别选定煎煮次数为1、2、3、4、5次，设定加水量为药材质量的8倍，提取时间60 min，提取样品 (每组3份)，按供试品溶液的制备方法，制备1～5组供试品溶液，计算固体得率，按苦参碱的测定方法进行测定，考察不同煎煮次数对固体得率和苦参碱量的影响，按“2.3”项下计算综合评分，结果分别为0.09、0.164、0.186、0.189、0.191。当煎煮次数为5次时，固体得率与苦参碱的综合得分最高，但当煎煮次数达到3次以上后，继续增加煎煮次数对固体得率与苦参碱的综合得分无显著影响。

2.5 慢性湿疹搽剂提取工艺条件的优化

2.5.1 响应面实验设计及响应值结果 在单因素考察的基础上，确定响应面的因素和水平，因素水平见表1。根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理确定的实验设计方案及响应值结果，见表2。

2.5.2 模型拟合及预测 根据响应面实验设计方案制备出15组供试品 (每组2份)，计算固体得率并按照苦参碱的测定方法进行测定，通过计算得出实验数据如表2。通过design-expert 7.0软件对响应值与各因素编码值进行回归拟合，得到回归方程如下:Y=+21.48+1.01X1+1.10X2+2.04 X3+0.35X1X2+0.13 X1X3－0.15X2X3－1.40－3.13－2.20。方差分析结果见表3。

表1 慢性湿疹搽剂提取工艺响应面分析因素水平

表2 慢性湿疹搽剂提取工艺试验设计及响应值

表3 慢性湿疹搽剂提取工艺回归模型与方差分析

由表3可知，用上述回归方程描述各因数与相应值之间的关系时，在置信区间95%时，因变量和全体自变量之间的线性关系显著 (r=0.9671)，模型的显著性水平远低于0.05，表明模型项是显著的。方程失拟项较小，表明该方程对实验结果拟合良好，实验误差小。因此，可以用该方程代替实验真实点对实验结果进行分析与预测。方程各自变量X方差分析表明，方程一次项对提取响应值具有显著性影响，影响的大小顺序依次为提取次数、提取时间、加水倍数，其中提取次数对提取响应值影响最为显著。方程二次项对提取响应值具有显著性影响，但交互项X1X2、X1X3、X2X3对提取响应值无显著性影响，因此各因素与响应值之间不是简单的线性关系。

2.5.3 等高线图和响应面图分析 根据回归分析结果，用design-expert 7.0软件作出响应曲面图和等高线图，见图1～3。各图表示X1、X2、X3中任意一个变量在取值范围内，其余2个变量对提取响应值的影响。

图1 加水量和提取时间对综合评分的影响

图2 加水量和提取次数对综合评分的影响

图3 提取时间和提取次数对综合评分的影响

根据以上响应面图，可以判断该实验范围内只有一个稳定点，且为极大值，同时表明本实验设计合理。因此，用design-expert 7.0软件，由RSM预测得出慢性湿疹搽剂的最佳提取工艺条件为:加水倍数12.03，提取时间131.23 min，提取次数3.47，结合单因素优化实验与生产实际的操作性，确定其最佳提取工艺为加水倍数12倍，提取时间130min，提取次数3次。理论上慢性湿疹搽剂提取响应值最高为0.2226。

2.5.4 验证试验 分别按优化的提取工艺提取3批样品，测定固体得率和苦参碱量，计算综合评分，慢性湿疹搽剂提取响应值为0.2212(RSD=0.42%)，与理论预测值相差不大，且高于表2实验结果的最高值，说明所建模型正确，且建立的工艺稳定、提取率高、重现性好。

3 讨论

本研究采用星点设计来进行试验，从而避免了均匀设计和正交试验不能预测出该因素在一个区间范围内连续取值的最佳值的缺陷，且较好地保证了试验精度 (可以分析各因素之间的相互作用)，预测性良好。根据方差分析结果可见，影响提取效果的大小顺序依次为提取次数、提取时间、加水倍数，其中提取次数对提取响应值影响最为显著。这可能与权重计算中苦参碱量所占比例较高有关，因浓度差对有效成分的溶出影响较大。

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