RP-HPLC法测定5种剂型的九味羌活制剂中紫花前胡苷、异欧前胡素

张幸福，范莹莹，王 菲，杨凤梅，骆桂法，刘海青

(青海省食品药品检验所，青海西宁 810016)

九味羌活方出自金代名医张元素，后元代医家王好古师从张元素之徒李杲学医，首次将九味羌活汤录于《此事难知》一书中［1］。具解表散寒，祛风除湿之功效［2］，为风寒感冒的首选良药。经现代制药技术制成九味羌活丸 (大蜜丸、小蜜丸、浓缩丸、水丸)和九味羌活颗粒［3-4］，在2009年收入国家基本药物目录。该系列制剂处方相同，由羌活、防风、苍术、黄芩、川芎、地黄、细辛、白芷和甘草等九味中药材组成。方中羌活、白芷均含有紫花前胡苷和异欧前胡素，为两味药材的主要成分［5-7］和活性成分［8-10］，查阅文献尚无该系列制剂中紫花前胡苷的测定方法［11-14］。本实验应用高效液相色谱梯度洗脱，对九味羌活5种剂型的紫花前胡苷和异欧前胡素进行了定量测定，方法涵盖市售的九味羌活系列的全部品种，可以为九味羌活制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

岛津LC-20ATVP型高效液相色谱仪，Sartrious BT224S电子天平 (德国 Sartrious公司)，Ohaus AR5120电子天平 (奥豪斯公司)，Hangping FA1004电子天平 (上海天平仪器厂)，超声波清洗器 (KQ5200B，功率200 W，频率40kHz，昆山市超声仪器有限公司)。

紫花前胡苷、异欧前胡素 (供含量测定用，批号111821-201001、110827-201008，均购自中国食品药品检定研究院)。液相用甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯 (市售)，水为超纯水。九味羌活系列制剂样品来自生产企业、经营单位及使用单位，包括大蜜丸、小蜜丸、浓缩丸、水丸和颗粒剂共5种剂型24批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［13-16］Diamonsil C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相A相为乙腈，B相为0.5% 冰乙酸水溶液，梯度洗脱 (0～35 min，10%→50%A;35～50 min，50%A→55A%;50～60 min，55%→80%A);柱温30℃;体积流量1.0 mL/min;检测波长330 nm;进样量10 μL;记录时间60 min。理论塔板数按异欧前胡素峰计算不低于2000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取紫花前胡苷0.01173 g置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得紫花前胡苷对照品贮备液。精密称取异欧前胡素对照品0.01053 g(纯度99.4%)置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得异欧前胡素对照品贮备液。精密量取紫花前胡苷贮备液5.0 mL，异欧前胡素贮备液1.0 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得 (每1 mL含紫花前胡苷23.46 μg、异欧前胡素8.37 μg)。

2.3 供试品溶液的制备 取各九味羌活制剂，研细混匀 (大蜜丸剪成细小碎粒)，取1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 专属性试验 根据九味羌活制剂的处方，取除去羌活和白芷的样品，照“2.3”项方法制备阴性供试品溶液。按“2.1”项色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、阴性样品溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，测定，即得。供试品色谱中，在与紫花前胡苷、异欧前胡素对照品色谱峰相应的位置上，有保留时间相同的色谱峰，阴性无干扰，见图1。

图1 九味羌活制剂的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Jiuwei Qianghuo preparations

2.5 线性关系考察 精密量取紫花前胡苷对照品贮备液 (0.2346 mg/mL)20 mL，置50 mL量瓶中，甲醇定容摇匀 (93.84 μg/mL)，取异欧前胡素贮备液 (41.87 μg/mL)适量，逐步稀释成含紫花前胡苷质量浓度为 0.938、2.815、7.507、18.768、37.536、46.920 μg/mL，异欧前胡素质量浓 度 为 1.256、2.512、4.187、8.374、12.561、16.748 μg/mL的混合对照品溶液，分别精密吸取10 μL，按“2.1”项条件，注入色谱仪测定，以进样量 (ng)为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归处理，得紫花前胡苷回归方程为Y=2.659×103X －2.539×103，r=0.9999;异欧前胡素回归方程为 Y=1.660×103X－38，r=0.9999，紫花前胡苷在9.38～469.20 ng、异欧前胡素在12.56～167.48 ng范围内线性关系良好。

2.6 定量限和检出限 检出限是指从背景干扰中区分出被测物的最低质量浓度。进1针甲醇，测出噪音的峰高，取紫花前胡苷和异欧前胡素对照品溶液，用甲醇逐级稀释进样测出峰高，按3倍和10倍信噪比计算出紫花前胡苷和异欧前胡素的检出限分别为0.28、1.34 μg/mL，定量限分别为0.75、2.51 μg/mL。

2.7 稳定性试验 取九味羌活水丸，按选定方法制备供试品溶液，室温下保存，分别于配置后0、3、5、10、18、49 h进样，按“2.1”项条件，注入液相色谱仪，测定并记录色谱图，考察其稳定性。紫花前胡苷峰面积的RSD为0.7%，异欧前胡素峰面积的RSD为0.6%。

2.8 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，连续进样5次，每次10 μL，测定紫花前胡苷峰面积的RSD为1.5%、异欧前胡素峰面积的RSD为1.2%，表明精密度好。

2.9 重复性试验 取同一批次九味羌活制剂样品，平行6份，取约1 g，精密称定，照“2.3”项方法制成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定。结果紫花前胡苷的RSD为1.6%，异欧前胡素的RSD为1.7%。

2.10 回收率试验 采用加样回收法，取已知含有量的九味羌活水丸 (紫花前胡苷为1.2549 mg/g、异欧前胡素为0.4753 mg/g)约0.5 g，平行6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入紫花前胡苷 (15.26 μg/mL)、异欧前胡素对照品溶液(5.024 μg/mL)50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按上述测定方法进行测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率考察结果Tab.1 Results of recovery tests

2.11 样品测定 取九味羌活制剂样品，照“2.3”项方法制成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，计算紫花前胡苷、异欧前胡素的量。测定结果见表2。

表2 样品测定结果Tab.2 Determination results of samples

3 讨论

3.1 黄芩、羌活、川芎、白芷、苍术和地黄等六味药材的特征峰在此色谱系统中均能体现，因此该系统分析时间较长。由于处方药材多，成分复杂，本实验只选取紫花前胡苷和异欧前胡素进行定量测定，尝试用甲醇-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.5%冰乙酸溶液等多种流动相，最后选择甲醇-0.1%冰乙酸为流动相梯度洗脱，在该条件下被测组分的峰形和分离度良好。本实验共测定不同生产企业的水丸11批，浓缩丸2批，大蜜丸4批，小蜜丸2批，颗粒剂5批，并以紫花前胡苷和异欧前胡素的总量来分析比较。

3.2 白芷的主要药效成分为挥发性成分，挥发性成分在放置过程中极易损失。紫花前胡苷和异欧前胡素的总量在大蜜丸、小蜜丸、浓缩丸中相对稳定。在水丸中二者总量差异明显，既表现在同一企业内，也表现在不同企业间。而在颗粒剂中的单独含有量及总量均较低。

3.3 水丸和蜜丸均为药材细粉用水泛丸或加炼蜜制丸;颗粒剂和浓缩丸中羌活、防风、苍术、细辛、川芎提取挥发油，白芷进行渗漉 (颗粒剂)或部分原粉 (浓缩丸)。同为喷入挥发油，浓缩丸中紫花前胡苷和异欧前胡素的量远远高于颗粒剂。据文献报道，欧前胡素长时间受热会损失高达40%［17］。曲永胜［18］认为挥发油是否影响九味羌活颗粒的疗效，需要进一步更深入的研究。目前对药物中挥发油的稳定性研究以 β-环糊精包合为主［19-21］。

［1］俞长榮.试论张元素的学术成就［J］.中医杂志，1962(5):38-41.

［2］张 彬，李玉玺.九味羌活丸的功效［J］.中成药研究，1982(9):45.

［3］国家药品监督管理局.国家中成药标准汇编:内科肺系(一)分册［S］.2002:143-147.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:448-450.

［5］杨秀伟，顾哲明.羌活化学成分的研究［J］.中草药，1993，24(10):507-511.

［6］王梦月，贾敏如.白芷的化学成分研究进展［J］.中药材，2002，25(6):446-449.

［7］Qiao Shanyi，Yao Xinshen，Wang Zhiyue.Counmarins of the roots of Angelica dahurica ［J］.Planta Med，1996，62(6):584.

［8］李云霞，高春华，沙 明.中药羌活化学成分及药理作用研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2004，6(1):22-23.

［9］吴亦琴，陈明明，赵宗惠，等.中药羌活的研究进展［J］.检验医学教育，2005，12(1):33-35.

［10］刘 元，李星宇，宋志钊，等.白花前胡丙素和紫花前胡苷祛痰作用研究［J］.时珍国医国药，2009，20(5):1049.

［11］宋九华，王 刚，刘素君.HPLC测定九味羌活丸中黄芩苷、甘草酸和异甘草素含量［J］.中成药，2010，32(11):1914-1916.

［12］秦春梅，刘友平，鄢 丹，等.九味羌活丸 (浓缩丸)质量标准研究［J］.中国实验方剂学杂志，2003，9(5):1-3.

［13］赵渤年，丁晓彦，刘 青.HPLC法测定九味羌活丸中异欧前胡素的含量［J］.山东医药，2008，48(26):94-95.

［14］赵渤年，刘 青，丁晓彦.HPLC法测定九味羌活颗粒中欧前胡素的含量［J］.药物分析杂志，2007，27(12):1967-1968.

［15］黄育生，袁贤琳，钟 瑜，等.HPLC法测定羌活中紫花前胡苷的含量［J］.中国民族民间医药.2013(10):14-15.

［16］陈 燕，易进海，刘云华等.中药羌活质量标准研究［J］.药物分析杂志，2010，30(5):945-949.

［17］刘 萍.HPLC法测定白芷提取挥发油前后欧前胡素含量［J］.实用中医药杂志，2004，20(8):470-470.

［18］曲永胜.不同工艺对九味羌活颗粒中欧前胡素及异欧前胡素含量的影响［J］.齐鲁药事，2009，28(11):692-694.

［19］高 燕，赵渤年，丁晓彦.多指标正交实验法研制九味羌活挥发油β-环糊精包合物［J］.时珍国医国药，2007，18(8):1901-1902.

［20］唐富丽，秦郁文.九味羌活颗粒挥发油β-环糊精包合工艺研究［J］.中国药师，2011，14(7):987-989.

［21］孙娟娟，解成喜.新疆圆柏实挥发油的β-环糊精包合工艺研究［J］.中成药，2013，35(1):185-187.