淫藤骨痹康方中7种活性成分的大孔树脂静态吸附性能研究

王元清，罗 堃，李顺祥*，严建业*，黄 丹，徐 菲

(1.湖南中医药大学药学院中药现代化教育厅重点实验室，湖南长沙 410208;2.中南林业科技大学生命科学与技术学院生物技术与工程实验室，湖南长沙 410004)

淫藤骨痹康方为治疗骨关节炎的临床经验方，由淫羊藿、白芍、丹参、枳壳、当归等十味中药组成，具有行气活血、通络祛痹、益肾壮骨的功效，用于治疗气血瘀滞、肝肾亏损型骨关节炎，其临床疗效显著。

骨痹康方中水溶性成分淫羊藿苷、芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷具有镇痛、抗炎等药理作用［1-3］;阿魏酸能够有效地抑制血小板的聚集［4］;原儿茶醛具有明显改善微循环的作用［5］。大孔吸附树脂的吸附分离方法已广泛应用于中药及中药复方的纯化研究中［6-7］，本研究考察7种活性成分的大孔树脂静态吸附性能，为淫藤骨痹康方活性成分在大孔树脂上的动态吸附的分离纯化工艺奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司);电子分析天平T-214(北京赛多利斯仪器系统有限公司);DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精弘实验设备有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海精弘实验设备有限公司);RE52-99旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试药 原儿茶醛对照品 (供含量测定用，批号110605)、橙皮苷对照品(供含量测定用，批号110721)均由南京泽朗医药科技有限公司提供;阿魏酸对照品 (供含量测定用，批号110773-200611)、芍药苷对照品 (供含量测定用，批号110736-200934)、柚皮苷对照品 (供含量测定用，批号110722-200610)、淫羊藿苷对照品(供含量测定用，批号110737-200415)均由中国食品药品检定研究院提供;新橙皮苷对照品(供含量测定用，批号111610-200604)由南昌贝塔生物科技有限公司提供;所有药材均购自安徽协和成药业饮片有限公司，经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定，并按《中国药典》2010年版要求检测，均符合规定。树脂AB-8、D101、NKA-9、DM130、HPD100(河北沧州宝恩化工有限公司);乙腈(色谱纯，美国Tedia试剂公司);水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 多成分的HPLC法测定

2.1.1 色谱条件 大连伊利特ODS2 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以乙腈 (A)-0.1%磷酸水溶液 (B)为流动相梯度洗脱 (0～8 min，15%～19%A;8～12 min，19% ～20%A;12～16 min，20% ～21%A;16～25 min，21% ～26%A;25～26 min，26% ～30%A;26～40 min，30% ～30%A;40～42 min，30% ～15%A);波长变化为316 nm→230 nm→283 nm→270 nm→316 nm(0→13→15→30→45 min)。体积流量1.0 mL/min;柱温30℃。对照品及样品的色谱图见图1。

图1 淫藤骨痹康方的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of Yinteng Gubikang Formula

2.1.2 对照品溶液的制备 取原儿茶醛、芍药苷、阿魏酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、淫羊藿苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，分别加甲醇制成20、40.8、23.6、43、25、106、18.4 μg/mL的对照品溶液，从中各精密移取1.0 mL对照品溶液置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 将大孔树脂吸附后的上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4 样品的测定 分别精密吸取混合对照品溶液15 μL、样品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标一点法计算。

2.2 大孔吸附树脂预处理 以95%乙醇浸泡树脂24 h，充分溶胀后湿法装柱，用95%乙醇通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊，并在200～400 nm处扫描没有紫外吸收，再用蒸馏水洗至没有醇味，抽滤至干，备用。

2.3 大孔吸附树脂静态吸附性能的研究

2.3.1 样品溶液的制备 称取淫藤骨痹康方水提浸膏，加水溶解，配制成实验用所需浓度的样品溶液。

2.3.2 不同型号树脂的筛选 称取2.0 g抽滤至干 的 湿 树 脂 AB-8、D101、NKA-9、DM130、HPD100分别置于具塞锥形瓶中，各加入骨痹康方样品溶液20 mL(生药质量浓度0.8 g/mL)，将锥形瓶置于恒温水浴箱锅中，并定时振摇，24 h后测定上清液中各成分的量，计算各树脂的吸附量。取上述吸附饱和的各树脂，先用50 mL水淋洗表面溶液，再分别加入100 mL 70%乙醇，定时振摇，24 h后，抽滤，测定滤液中各成分的量，计算各树脂对各成分的吸附量与解吸率。结果见表1～3。采用Topsis综合评价法评价各树脂对7种成分的吸附量×解吸附率，优选最佳树脂，分析结果见表4～5。

由表1可知，不同成分在同一树脂上的吸附量不同，同一成分在不同树脂上的吸附量也不同，都存在较大的差异;由表2可知，不同成分在同一树脂上的解吸率不同，同一成分在不同树脂上的解吸率也不同，都存在较大的差异;由表5可知，五种树脂对7种成分的综合吸附-解吸附性能为HPD100﹥NKA-9﹥D101﹥AB-8﹥DM130。

表1 5种大孔树脂对淫藤骨痹康方中7种成分的静态吸附量Tab.1 Static absorption of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表2 5种大孔树脂对淫藤骨痹康方中7种成分的静态解吸附率Tab.2 Static desorption of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表3 5种大孔树脂对淫藤骨痹康方中7种成分的综合吸附-解吸附性能Tab.3 Comprehensive absorption and desorption capability of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表4 5种大孔树脂对淫藤骨痹康方中7种成分的综合吸附-解吸附性能的变换阵距Tab.4 Transformation matrix of the comprehensive absorption and desorption capability of seven components from Yinteng Gubikang Formula on five macroporous resins

表5 不同树脂的排序指标值Tab.5 Scheduling index value of different resins

2.3.3 pH的考察 称取已处理好的HPD100大孔树脂6份，每份2.0 g，分别置于6个具塞锥形瓶中，加入样品溶液20 mL(生药质量浓度0.8 g/mL)，一份不调pH，其他5份分别调节pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将锥形瓶置于恒温水浴箱锅中，定时震摇，24 h后测定上清液中各成分量，计算树脂的吸附量。结果见表6。采用Topsis综合评价法评价不同pH下对7种成分的吸附量，优选最佳pH，结果见表7、表8。

表6 pH对淫藤骨痹康方中7种成分静态吸附性能的影响Tab.6 Effects of pH values on the static adsorption of macroporous resins

表8 不同pH值样品的排序指标值Tab.8 Scheduling index value of samples with different pH values

由表8可知，将样品溶液调节pH值为5.0时，HPD100大孔树脂对7种成分的综合吸附性能较好，因而可将pH值调节为5.0。

2.3.4 样品质量浓度的考察 称取已处理好的HPD100大孔树脂4份，每份2.0 g，分别置于4个具塞锥形瓶中，分别加入一定浓度样品溶液，样品溶液的生药质量浓度为0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL。将锥形瓶置于恒温水浴箱锅中，定时振摇，24 h后测定上清液中各成分量，计算树脂的吸附量。结果见表9。采用Topsis综合评价法评价HPD100大孔树脂对不同质量浓度样品中7种成分的吸附量，优选最佳样品浓度，结果见表10、表11。

表9 样品质量浓度对淫藤骨痹康方中7种成分静态吸附性能的影响Tab.9 Effects of sample concentration on the static absorption of macroporous resins

表10 样品质量浓度对淫藤骨痹康方中7种成分静态吸附性能的变换阵距Tab.10 Transformation matrix of the effects of sample concentration on the static absorption of macroporous resins

表11 不同质量浓度样品的排序指标值Tab.11 Scheduling index value of samples with different concentrations

由表11可知，当样品溶液的生药质量浓度为0.6 g/mL时，HPD100大孔树脂对7种成分的综合吸附性能较好，因而可将样品溶液生药质量浓度定为0.6 g/mL。

2.3.5 静态吸附曲线的考察 称取2.0 g HPD100大孔树脂装于具塞锥形瓶中，加入60 mL生药质量浓度为0.6 g/mL的样品溶液，将锥形瓶置于恒温水浴箱锅中，定时振摇，分别于15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h取样，测定7种成分的吸附量，结果见图2、表12。

由图2可知，方中所考察的成分在1～2 h达到静态平衡;由表12可知，样品的静态吸附过程在24 h内吸附量与时间的关系可用相关的数学方程拟合，P值均小于0.05，表明方程具有统计学意义。

图2 不同成分在HPD100大孔树脂上的静态吸附曲线Fig.2 Static absorption curves of the different components on macroporous resins

表12 淫藤骨痹康方中7种成分在HPD100大孔树脂上的静态吸附量-时间的数学方程拟合Tab.12 Mathematical equation of static absorption-time of different components

3 讨论

3.1 多成分的定量测定中，在文献 ［8］的基础上反复摸索，考察了色谱柱、流动相、波长等。色谱柱考察了 Diamonsil C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)、大连伊利特 ODS2 C18色谱柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm)、NUCLEOSIL C18色谱 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)等，发现大连伊利特ODS2 C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)的柱效较高，分离性能较好。流动相分别考察了乙腈-醋酸水、乙腈-磷酸水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-醋酸水、甲醇-磷酸水等系统，发现乙腈-磷酸水系统的洗脱条件较好，并在梯度洗脱条件下可将样品中的7个活性成分较好地分离，基线平稳。波长选择中，考察了230、283、316 nm等，发现在可变波长条件下，样品中各成分的吸收峰较大，因而选择可变波长。通过此条件的摸索，优化了淫藤骨痹康方中7种活性成分的HPLC分离测定条件，该定量测定方法已进行方法学考察确证，将另文发表。

3.2 综合评价是利用数学方法 (包括数理统计方法)对一个复杂系统的多个指标信息进行加工和提炼，以求得其优劣等级的一种评价方法，主要方法有:层次分析加权法、相对差距和法、主成分分析法、Topsis法、秩和比法、全概率评分法、人工神经网络、因子分析法等［9］。其中Topsis法已应用于中药质量的研究中［10-11］，其原理为在归一化后的原始矩阵中，找出有限方案中最优方案与最劣方案 (分别用最优向量与最劣向量表示)，然后计算出评价对象与最优方案和最劣方案间的距离，获得该评价对象与最优方案的相对接近程度，并作为评价优劣的依据。其基本模型为:Ci=Di－/(Di++Di－)其中:Di－为评价方案到最劣方案间的距离。Di+为评价方案到最优方案间的距离。Ci为样本点到最优样本点的相对接近度。Ci接近于l时，评价方案越接近于最优方案。本实验采用Topsis法综合评价中药复方多指标的大孔树脂静态吸附脱吸附工艺，获得了满意的结果。

3.3 淫藤骨痹康方是由十味中药组成的大复方，预实验研究表明，该方的水提液的浸膏得率较高，因而需进一步纯化。目前大孔树脂在中药复方活性成分富集中的应用也日渐增多，它具有吸附容量大，解吸附率高，树脂可以简单再生等特点。本实验采用大孔树脂静态吸附该方的水溶性活性成分，旨在进一步为动态吸附工艺研究提供基础。不同pH条件下，综合吸附量存在较大差异，这与骨痹康方中的多种成分的竞争性吸附有关，在吸附过程中，pH的改变，使水溶性成分所存在的体系得以改变，从而改变了成分的解离性能，这样就改变了样品的吸附性能。静态吸附曲线考察中，树脂对7种成分的饱和吸附量不同，除了与成分本身的结构特点有关外，还与成分初始浓度有关，初始浓度大，相对的吸附量要高。在静态吸附研究中发现，不同成分在同一树脂上的吸附量与解吸附率不同，同一成分在不同树脂上的吸附量与解吸附率也不同，都存在较大的差异。研究表明HPD100对7种成分的综合吸附-解吸附性能优于其他树脂，可用于淫藤骨痹康方的纯化研究中。

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