4q31区域STR位点D4S413多态性与中国汉族人群非综合征型唇腭裂的关联研究

吴 镝, 王新刚, 王 玫, 宋 涛, 尹宁北, 赵振民

实验研究

4q31区域STR位点D4S413多态性与中国汉族人群非综合征型唇腭裂的关联研究

吴 镝, 王新刚, 王 玫, 宋 涛, 尹宁北, 赵振民

目的探讨4q31区域STR位点的基因多态性与中国汉族人群非综合征型唇腭裂发生的相关性。方法收集中国医学科学院整形外科医院214个非综合征型唇腭裂核心家系(患者及其父母)样本。在4号染色体4q31-q32分布10个短串联重复序列位点。采用ABI 3730DNA分型仪进行短串联重复序列位点的基因分型。分别采用Mendel和FBAT两种软件进行传递不平衡检验分析。结果采用Mendel软件进行传递不平衡检验分析，短串联重复序列位点D4S413与中国汉族人群非综合征型唇腭裂有相关性(P=0.0372)，采用FBAT软件进行传递不平衡检验分析发现，短串联重复序列位点D4S413的与中国汉族人群非综合征型唇腭裂有相关性(P=0.01974)，等位基因297过传递。但经过多重检验校正后，P>0.05。结论4q31区域短串联重复序列位点D4S413可能与中国汉族人群非综合征型唇腭裂关联，但需要大样本量进行验证。

非综合征型唇腭裂； 短串联重复序列； 传递不平衡检验

唇腭裂是最常见的出生缺陷之一，其发病率随种族和地域不同而有明显变化。临床中最常见的非综合征型唇腭裂(nonsyndromic cleft lip with or without palate, NSCLP)是一种多基因复杂疾病，其致病风险因素包括遗传因素、环境因素以及遗传与环境因素的交互作用。近年来，通过连锁分析(linkage analysis)[1]和全基因组关联研究(genome-wide association study, GWAS)[2-3]，相继发现了一些新的易感基因和区域，但是多数位点并未找到明确的致病突变。自2000年初开始，多个研究小组通过基于家系的全基因组连锁分析，陆续发现了一些易感区域：1q32、2p、3q27-28、9q21、14q21-24、16q24。由于种族差异、地域差异等异质因素的影响及样本量不足等因素，造成结果的重复性较差。其中，Marazita于2002年选取了36个中国上海复杂家系，387个短串联重复序列(short tandem repeats, STR)位点，完成了唯一一次针对中国人群的全基因组扫描进行连锁分析后发现，其多点HLOD最高峰在4q31(2.5，α= 0.37)[1]。并且该位点在其他民族(菲律宾人[4]和叙利亚人[5])中也得到支持。经美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)检索发现，4q31已被在线人类孟德尔遗传数据库收录，命名为OFC4。笔者的研究以汉族人群的结果为主要参考，结合其他研究结果，尤其是黄色人种，确定4q31为候选区域，进行精细定位。

1 对象与方法

1.1 研究群体

样本来源于中国医学科学院整形外科医院唇腭裂中心2011-2013年收录的中国汉族人群非综合征型唇腭裂核心家系(包括患儿及其父母)。为排除综合征型唇腭裂的影响并对患者进行正确的分级，我们对所有的患儿及其父母进行了详细的问卷调查，并由2名专科医师分别进行唇腭部检查。收集所选样本的唇腭裂家族史情况、性别、年龄、是否有其他重大疾病等流行病学资料及母亲孕期受过致畸物质影响的患者；排除母亲孕期大量吸烟、酗酒的患者。入选者均为非综合征型唇腭裂家系。

共选取核心家系214个，其中完整核心家系(即包括患儿及其父母)205个，不完整核心家系(即患儿及其父亲或母亲)9个，22个家系有阳性家族史。与入选家系成员签定知情同意书，本研究中所涉及样本的采集、临床检测、基因筛查与功能分析等，均通过本单位伦理审查委员会批准，并在患者及家属知情情况下进行。为患者保密，并严格遵守国家相关法律法规。

1.2 DNA的提取及定量分析

分别抽取核心家系成员静脉血6 ml，用于基因组DNA的提取。应用基因组DNA纯化试剂盒QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN-Sample & Assay Technologies, 德国)，提取血样中的基因组DNA。所提DNA先根据电泳结果初步判断提取质量，再应用NanoDrop ND1000紫外可见分光光度计(NanoDrop Technologies, 美国)测定DNA质量和浓度，保证样本的一致性。

1.3 STR分型

STR荧光位点尽量选用杂合度大于0.6的2～4个核苷酸重复序列，产物长度尽量控制在150～250 bp。根据NCBI提供的基因组图上短串连重复序列荧光位点位置及顺序，在目标区域染色体4q31上(物理距离34 Mb)根据基因密度，平均且合理分布10个短串连重复序列荧光位点。其中D4S413为美国应用生物系统公司(Applied Biosystems, ABI) Linkage Mapping Set version 2.5中的商用荧光位点引物(引物序列未提供)；其余引物均根据NCBI上提供的引物序列，由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)合成，5′末端FAM羧基荧光素修饰。STR具体数据见表1。

应用PCR技术(ABI PCR基因扩增仪2720)对目的片断进行扩增。每5 μl PCR反应体系含有10 ng全基因组DNA作为模板，在PCR扩增缓冲体系中含有25 mM MgSO40.4 μl，2.5 mM dNTP 0.5 μl，缓冲液0.5 μl，正反向引物混合物1.0 μl，TaKaRa Taq酶0.04 μl。产物纯化后，采用ABI 3730自动基因分析仪毛细管电泳技术扫描PCR扩增产物，用3730/3730xl Data Collection Software v 3.0软件，将电泳收集的电泳图谱信息，经过电子计算机处理成数据信息。

1.4 统计学分析

对核心家系的基因分型结果进行孟德尔遗传错误检查。应用Mendel 8.0.0软件中的Genetic Equilibrium功能，计算每个STR位点基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用传递不平衡检验(transmission disequilibrium test, TDT)来定位与非综合征型唇腭裂相关的位点。TDT算法已植入多个软件，不同的软件对于TDT算法有不同的扩展。本研究分别采用两个软件Mendel和FBAT进行TDT分析，以期得到更加公允的结果。我们对214个家系进行了TDT检验。FBAT可设置显性、隐性和加性遗传模式来检验关联。

2 结果

2.1 样本临床基本资料分析

214例患者中，男性156例，女性58例，男女比例为2.7∶1.0。患者年龄2个月至23岁，平均3岁。这214个家系中，22个家系报告有阳性家族史，192个家系否认有家族史。按NSCLP亚型分类，唇裂伴腭裂103个，单纯唇裂111个。

表1 STR位点及引物列表

2.2 样本DNA质量分析

电泳分析可见，从抗凝静脉血中提取出的全基因组DNA，在凝胶上显示条带清晰，无杂带。即认为所提取出的全基因组DNA样本完整，无降解，可用于PCR扩增。经NanoDrop ND1000测定，DNA浓度最高值达120 ng/μl，最低值为10 ng/μl，基本保持在40 ng/μl，OD260/OD280基本保持在1.8。因此，认为DNA浓度达到STR基因分型实验需求。

2.3 STR基因型结果的统计分析

STR位点D4S1603、D4S2431共测390个样本，即130个家系；D4S1644、D4S2998、D4S3021实测537个样本，即179个家系；D4S1629、D4S413、D4S1498、D4S1589和D4S1556实测642个样本，即214个家系。所有STR位点基因分型成功率保持在95%以上。图1为经3730/3730xl Data Collection Software v 3.0软件收集的电泳图谱信息，图2为经Genemarker软件处理的STR峰图。

图1 D4S3021典型电泳图谱图2 D4S3021典型杂合子峰图Fig1 Typical electrophoregram of D4S3021.Fig2 Typical heterozygote peak of D4S3021.

2.4 孟德尔遗传错误检查结果

部分家系在多个STR位点的基因型出现孟德尔遗传错误，认为其家系关系不明确，故在后续分析过程中去除这类家系。

2.5 Hardy-Weinberg平衡检验结果

对父母基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验，所有STR位点P>0.05，因此，所选取的研究样本的基因型符合整个群体的情况；对患儿的基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验，所有STR位点P>0.05，即患儿的基因型与整体人群并没有明显的偏离。

2.6 TDT分析结果

2.6.1 Mendel软件对TDT分析结果 采用Mendel软件，对所有通过孟德尔遗传错误检查的可用家系进行TDT分析，得到TDT1的P值、TDT2的P值、传递和未传递的风险等位基因数(表2)。各STR位点根据等位基因频率合并等位基因，使其最小等位基因频率达到0.1，之后进行TDT计算。采用TDT1算法，在STR位点D4S413的P<0.05，否定零假设，认为在该位点对TDT的检验，具有显著的统计学意义，D4S413与NSCL/P有相关性。

2.6.2 FBAT软件对TDT分析结果 采用FBAT软件进行TDT分析，可采用不同的遗传模式进行分析。

表2 Mendel软件的TDT分析结果

注：*P< 0.05

当选用相加遗传模型，多等位基因模式时，STR位点D4S413的P<0.05 (P=0.01974)。但经过多重检验校正后，P>0.05，无统计学意义。显性遗传模型多等位基因模式下，STR位点D4S413的P<0.05(P=0.014661)。隐性遗传模型多等位基因模式下，只有7个STR位点可用该模型计算。且所有可计算位点P>0.05。

3 讨论

本研究基于以往实验已经得到的结果，选用NSCL/P核心家系样本，采用TDT分析方法，对中国汉族人群NSCL/P易感基因候选区域4q31-q32进行深入地研究。这一区域已有多项研究支持，但并未定位到致病基因。1994年，S Beiragh发现，其中2个位点D4S175和D4S192与唇腭裂有连锁关系。在对中国36个唇腭裂家系的全基因连锁分析研究中，Maraxita等[1]发现，在隐性遗传模式下，位于4q的STR位点D4S1629存在多点HLOD最高值(2.5)。2003年，S Beiraghi在一对患唇腭裂的父子中，检测到4号染色体有平衡臂间倒位，inv(4)(p13q21)。发现4q21的断裂点干扰了SCD5基因2号外显子。

在本研究中，TDT分析发现NSCL/P和STR位点D4S413可能有关联。在D4S413区域附近有PDGFC、GLRB和GLRA2三个基因。其中血小板源生长因子PDGF在哺乳动物器官形成的多个阶段起重要作用[6]。PDGF通过与PDGF受体(PDGFRs)结合而发挥作用。其中，PDGF-CC与PDGFR-αα和-αβ结合。研究发现，PDGFR-α对神经脊细胞的发育和正常颅面发育起重要作用(P Soriano, 1997年)。生化实验和活体基因靶实验证实，PDGF-C是PDGFR-α信号通路上一个重要组成[7]。PDGF-C和PDGFR-α在胚胎和出生后的生长发育，特别是在腭发生过程中起重要作用。

在动物模型中已验证，Pdgfr-α突变，以及其Pdgf配体，包括Pdgf-c突变，会影响颌面发育，导致颌面裂。另外，通过基因敲出(Pdgfr-α-/-小鼠模型)或致畸原(维甲酸)抑制PDGF-C表达活性，会干扰在鳃弓发育过程中MMPs和TIFs的作用[8]。PDGF-C的表达还会受到FGF信号通路和小分子类泛素修饰因子(small ubiquitin-like modifier modification, SUMO)的影响[9]。由于FGF信号通路的改变，也会导致腭裂的发生，SUMO和PDGF-C之间的相互作用，以及和环境危险因素的相互作用，都会影响唇腭裂的易感性。

目前，已有多个针对PDGF-C与人类NSCLP的相关研究[10-12]。在NSCL/P患儿的PDGF-C启动子区域rs17035464到D4S1498，长度约14 kb，出现片段性母源单亲二体性现象。以上对人类NSCLP的研究，PDGF-C有阳性发现的研究样本，都来自于中国人群，提示PDGF-C可能是中国人群特有的易感基因。

综上所述，本研究通过TDT分析发现，NSCL/P和STR位点D4S413相关 (P= 0.01974)。等位基因297过传递。但是，经过多重检验校正后，P>0.05。因此，认为D4S413可能与NSCL/P关联，D4S413附近的PDGFC基因突变，可能导致腭裂的发生，但需要更大的样本量以及进一步实验来验证。

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AssociationstudybetweenSTRmarkerD4S413polymorphismon4q31andnonsyndromiccleftlipwithorwithoutpalateinHanChinese

WUDi,WANGXin-gang,WANGMei,etal.

(CenterforCleftLipandPalate,PlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalScience,Beijing100144,China)

ObjectiveTo explore the association between D4S413 polymorphism on 4q31 and nonsyndromic cleft lip with or without palate in Chinese Han people.MethodsWe collected 214 NSCLP case-parent trios recruited through CL/P treatment center in Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. 10 STR markers were selected on 4q31-q32. STR markers were genotyped by ABI 3730 DNA analyzer. The transmission disequilibrium test (TDT) was analyzed using two programs, Mendel and the family-based association test (FBAT).ResultsAnalyzed by Mendel, we founded significant association between the disease status and STR marker D4S413 (P= 0.0372). Analyzed by FBAT, we founded most-significant association between the disease status and STR marker D4S413 (P= 0.01974). Allele 297 was more frequently transmitted to the affected children. However, after multiple tests correction, the p-value did not touch the borderline.ConclusionAssociation may exist between D4S413 on 4q31 and nonsyndromic cleft lip with or without palate in Han Chinese. A large amount of samples will be included in the further study.

Nonsyndromic cleft lip with or without palate; Short tandem repeats; Transmitted disequilibrium test

国家自然科学基金项目资助(81101440)

100144 北京，中国医学科学院整形外科医院 唇腭裂中心(吴 镝，宋 涛，尹宁北，赵振民)；首都医科大学附属北京儿童医院 口腔科(王新刚)；卡罗林斯卡医学院公共卫生学院 流行病学系(王 玫)

吴 镝(1979-)，女，辽宁朝阳人，主治医师，博士.

赵振民，100144，中国医学科学院整形外科医院 唇腭裂中心，电子信箱:zhaozhenmin0098@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.017

R329.23

A

1673-7040(2014)12-0747-04

2014-08-31)