分子间多量子相干方法及其在生物组织中的应用①

张连娣，王楚楚，林雁勤，陈 忠

(厦门大学物理系，福建 厦门 361005)

高分辨率的核磁共振 (Nuclear Magnetic Resonance，NMR)谱能为物质的结构分析及谱峰归属提供有价值的信息。自1945年底，Purcell小组和Bloch小组分别独立地观测到核自旋系统产生的NMR信号［1－3］以来，NMR展现出极强的生命力和广阔的应用前景，已成为物理学、化学、生物及医药［4］等领域最广泛应用且最有力的谱学工具之一。

然而，在过去的十多年间，在高极化 (高浓度)核自旋体系中却出现了一些不能用常规NMR理论来解释的实验现象。1990年，Warren小组［3］在500M谱仪上采用三脉冲序列{(π/2)x－τ－(π/2)－x－t1－(π/2)x－t2}对80%H2O+20%D2O样品做二维 (two Dimension，2D)谱实验时，在间接维(F1)观察到了多量子相干 (Multiple－Quantum Coherence，MQC)信号。1993 年 Warren 小组［5，6］采用有梯度场参与的二脉冲序列 (即CRAZED脉冲序列)，对80%H2O+20%D2O样品做2D谱实验时，再次发现相似的实验现象。这些实验现象都与传统的NMR理论矛盾，据此Warren等从量子的角度指出这些峰是由分子间的偶极耦合作用产生的。之后在两个假设［7］的基础上，Warren等［6］提出了分子间多量子相干 (intermolecular Multiple－Quantum Coherence，iMQC)这一突破性概念。

决定NMR谱效用的关键标准是线宽和线形，而传统NMR信号的线宽和样品感受到的磁场不均匀性密切相关，为了得到高分辨率的NMR谱，必须消除磁场不均匀性。而iMQC信号源于分子间远程偶极相互作用，其有效范围在5－500μm之间，远小于样品的一般尺寸，因此吸引谱学工作者将其应用于不均匀场下获取高分辨率谱。近年来，iMQC被证明是在不均匀磁场下获得高分辨率NMR谱的非常有前景的方法。

1 分子间多量子相干的基本理论

自从iMQC概念提出后，由于其特有的性质被广泛用于在不均匀场下获得高分辨率的NMR谱。而且高分辨率NMR谱的所有主要信息，包括化学位移、多重裂峰模式、耦合常数和相对峰面积，都能得以保留，这对物质分析以及谱峰归属十分有利。

下面介绍一下由Warren小组首先提出的HOMOGENIZED(HOMOGeneity Enhancement by Intermolecular Zero－ quantum Detection)方法［8］，该方法在2D谱的F1维大大提高了谱图的分辨率，序列如图1所示。

图1 基于分子间零量子相干的HOMOGENIZED序列

考虑一个由I和S两种同核1/2自旋组分组成的均匀溶液，假设I为浓的单自旋体系溶剂，S为稀的或浓的AX体系溶质，JAX为SA和SX的标量耦合常数。实验中通过探头失谐［9］和不均匀场来消除辐射阻尼效应，在下面的讨论中忽略其影响。ωm为自旋m(m=I，SA，SX)在均匀场中的频率偏置，ΔB(r)为磁场的空间不均匀性，考虑ΔB(r)后，自旋m在位置r的频率偏置可表示为:Ωm(r)=ωm+ γ.ΔB(r)，(m=I，SA，SX，γ 为磁旋比) (1)

iZQC信号的进动频率为:

(2)式表明分子间零量子相干 (intermolecular Zero－Quantum Coherence，iZQC)以两自旋的进动频率差演化，因为长程偶极相互作用耦合的两个自旋在空间位置上靠近，远小于偶极相关长度dc=π/(γGδ)，G、δ分别为iZQC相干选择梯度场脉冲的强度和持续时间。偶极相关长度间两自旋之间的磁场不均匀性几乎相同，即 ΔB(r)≈ ΔB(r＇)，所以iZQC峰的进动频率大约为 ωm－ωn，可见iZQC信号对磁场不均匀性不敏感，几乎没有不均匀展宽。

上面讨论的是最早利用iMQC来获得高分辨NMR谱的方法，之后也有对此序列的其他改进，如在不均匀、不稳定场下，lin等结合Carr－Purcell－Meiboom－Gill(CPMG)多自旋回波方法和HOMOGENIZED方法，设计出了CPMG－HOMOGENIZED高分辨序列，陈忠组改进得到的SELHOMOGENIZED序列等。此外，其他用于获得高分辨谱的脉冲序列也不断涌现，如陈忠组提出的带有溶剂峰压制，［10，11］不同 J 耦合调制［12］等序列;Faber小组设计出的压制溶剂峰的iZQC的改进序列。［13］这些序列的基本原理都是利用iMQC。

2 分子间多量子相干方法在活体及生物组织中的应用

在活体或者组织样品中，磁场的均匀性往往受到样品磁化率变化的影响 (如活体中骨头与组织的交界处等)使磁场变得不均匀。在这种情况下，iMQC方法可用于消除不均匀场所带来的不均匀增宽效应，从而获得高分辨率的NMR谱，对物质的结构和组成进行分析。近年来iMQC方法在生物组织和活体中有着广泛的应用。

2.1 分子间零量子相干方法的应用

2.1.1 分子间零量子相干应用于葡萄提高谱图分辨率

由Warren等提出的HOMOGENIZED脉冲序列如图2(a)，是利用iZQC来获得2D谱并且可以在F1维得到高分辨率的NMR谱。2003年Faber小组在17.6T的场强下第一次把该序列应用于活体谱。［14］

图2 葡萄的HOMOGENIZED谱

图2 为第一次在17.6T下把该序列应用于完整葡萄获得的谱图。在仅仅6分钟内就得到能分辨出葡萄糖H1α和H1β峰的谱图 (如图2a)，该实验是为了优化至在最短的采样时间分辨出H1共振峰，因此只能分辨出部分葡萄糖峰。由于没采用相位循环，谱图中有残留的COSY信号。图2(b)为从含有1024个t1增量的实验数据集中截取的256个t1增量，傅里叶变换为2048×512矩阵所得谱图的放大区域。从谱中可以观测到线宽从F2维大约0.12ppm下降到F1维大约0.04ppm。还可以观测到位于3.22/4.63和3.54/5.23ppm处的谱峰，这些峰源于水和葡萄糖的α和β端基差向异构体的H1/H2之间J－耦合的偶极耦合。位于4.38，2.96，2.78ppm处的3个峰为天冬氨酸 (Asp)的共振峰。HOMOGENIZED序列也可用于活体鼠脑［14］来提高谱图分辨率。

HOMOGENIZED序列能用于活体中消除由磁化率梯度引起的谱线增宽，并能探测到活体中毫摩尔浓度的代谢物。假如HOMOGENIZED与定域谱结合将有可能应用于包含空气组织的NMR谱中，例如哺乳动物的肺或植物的叶子等。

2.1.2 不均匀场下有效压制溶剂峰的iZQC高分辨率谱在葡萄中的应用

强大的溶剂信号一直以来都是获得高分辨率NMR谱的障碍。2007年陈忠小组提出了一种能在不均匀场下有效压制溶剂峰并能获得高分辨谱的iZQC方法［10］(脉冲序列如图3)。

图3 iDQF－HOMOGRNIZED脉冲序列

黑条:硬RF脉冲，高斯形状:只选择自旋I(对应溶剂)的RF脉冲

在该序列中假如相干选择理想，射频 (Radio Frequency，RF)脉冲α=π，β=π/2不仅能够完全消除溶剂iZQC信号，而且需要的溶质信号也能达到最大化。另外该序列获得谱图的J耦合常数和强耦合多重裂峰模式与常规1D谱一致，只是强耦合裂峰的强度会发生变化。

图4 葡萄果肉的谱图

分别来源于:(A)单π/2 RF脉冲;(B)iDQF－HOMOGENIZED谱切变后在F1维的1D投影谱;(C)均匀场下同样葡萄汁液的1D常规谱;(D)和 (B)的数据相同的未经切变的2D谱，插图是放大的视图

图4A为葡萄果肉的常规1D谱，水峰线宽约为100Hz，从中几乎无法得到任何代谢物信息。图4B为经过处理的iDQF－HOMOGENIZED的投影谱，其线宽明显窄化，水峰抑制效果明显，能分辨出水峰附近的beta－ (距水峰0.2ppm)和alpha－葡萄糖 (距水峰0.4ppm)，而在常规1D谱中完全被水峰淹没。图4D为没有进行切变处理的iDQF－HOMOGENIZED的2D谱，在谱峰重叠的区域内，很多谱图信息得以恢复。iDQF－HOMOGENIZED的1D投影谱与1D高分辨率葡萄汁的谱图 (图4C)较为相似，具有较理想的SNR。

虽然上述方法能有效压制溶剂峰，但采样时间较长，在活体中应用谱图分辨率会受到一定的影响。Warren小组提出的超快速 iZQC方法［15］可以在单次数据采集扫描中获得iZQC信号。这种方法可以看成在一次HOMOGENIZED实验中不同t1的四次叠加，采样效率高。对于低温下的变温动物该方法可以使谱图的分辨率提高一个数量级，图5为用该方法获得的4°下活蚯蚓的谱图，iZQC谱的F1维线宽比沿着直接维不均匀展宽的线宽窄很多。

图5 4°时活蚯蚓的谱图

2.1.3 基于iZQC的方法应用于活体内探测由饮食引起的脂肪组织成分的变化

脂肪酸在细胞代谢和人类疾病预测中有重要的作用，因此在活体内探测组织脂肪酸成分的方法极其重要。2011年Warren小组提出了一种只需要单次实验就可以从分布于较大体积 (几个立方厘米)的脂肪组织样品中获得脂肪成分信息的方法［16］(脉冲序列如图6)。对于喂食富含多元不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA)食物和标准食物的老鼠，该方法能区别出其脂肪组织成分的明显不同。

图6 iZQC脉冲序列

图7 C为用该方法采得的谱图，可以看出iZQC谱与标准1D谱对比分辨率明显提高，压水效果较好。另外CH2亚甲基质子与下列基团的耦合:CH3质子 (P2－P1)，CH2(P2－P2)，烯基 (P2－P9)，烯丙基亚甲基 (P2－P4)，α亚甲基 (P2－P5)，二烯丙基亚甲基 (P2－P6)这些峰清晰可见。

图7 肥胖老鼠的磁共振波谱

图8 两组老鼠的磁共振波谱

说明iZQC方法对磁场不均匀不敏感，并且对源于瘠瘦组织的水信号有良好的压制效果。图8为两组老鼠分别在4周和12周时图7圈出谱峰区域的放大图，在iZQC谱中明显看出由于PUFA饮食引起的脂肪酸成分的变化，也被图8G、H所证实。与PUFA相对应的P6－P2峰，其强度在PUFA饮食组迅速增加，并且相对于P4－P2峰随时间增加，反映了在PUFA饮食下脂质成分随时间的变化。

这种方法可用于分析小鼠体内由饮食干预引起的脂肪组织成分的变化。另外该方法还被用于在活体内探测棕色脂肪组织并用水－脂质iZQC信号进行表征。［17］由于其高分辨率和灵敏度，还将有可能用于研究其他高度不均匀器官 (如肝脏)的脂肪酸成分，而且对由运动以及脂肪代谢疾病引起的脂肪酸成分的微小变化的快速检测也有一定的应用前景。

2.2 分子间零量子相干方法与定域相结合及其在肿瘤和大鼠脊髓中的应用

2006年Faber小组提出了三种可能把定域和HOMOGENIZED实验结合起来实现定域远程偶极场谱的方法，［18］但只有在采样前定域的 S3方法(脉冲序列如图9)能够应用于活体中得到充分空间选择和良好灵敏度的谱图。

图9 采样前定域的空间定域HOMOGENIZED谱的S3脉冲序列

黑条:非选择性RF脉冲，sinc和gauss形:选择性RF脉冲，t1和t2:时间间隔，深灰色梯形:片选梯度，灰色三角形:破坏梯度。

一般情况下随着体素增大不均匀场增强，谱图质量和SNR会急剧恶化，而HOMOGENIZED谱不受其影响，反而随着体素增大，SNR增加。为证明这一点，把S3序列应用到大腿中植入一个直径为5－7mm肿瘤的老鼠模型中。从这个模型的不同体素中分别采得了PRESS谱 (如图10)。在 (2mm)3的体素中，观测到Cho峰的线宽为85Hz。小尺寸肿瘤的不均匀结构使从 (4mm)3，(6mm)3的体素中获得谱图的质量下降 (图10b、c)。而只要体素位于肿瘤结构边界以内，定域iZQC谱不受所选体素体积大小的限制。图11为用S3方法获得的HOMOGENIZED定域谱的f1维投影谱，所用样品与图10相同，体素大小为 (6mm)3。(a)、(b)、(c)谱的采样时间分别为25min，13min，7min，对应Cho峰的线宽分别为55Hz，110Hz，220Hz。谱图质量不受体素大小的影响，但线宽随t1增量的数目缩放，t1增量最小时，SNR最好。图11还表明iZQC技术能有效压制水和脂肪信号，而且对于较大体积体素的研究如整个脑代谢物，iZQC技术有明显的优势。

图10 含有FaDu肿瘤的活体老鼠的PRESS谱

图11 S3序列获得的含有FaDu肿瘤的活体老鼠((6mm)3体素)的iZQC定域谱的f1维投影谱

2007年faber小组［19］又把该方法应用于大鼠的脊髓中。图12［20］(b)为用该方法从图12(a)所示的4×4×25mm3体素中采得的活体大鼠脊髓的HOMOGENIZED谱，可以分辨出大鼠脊髓的主要代谢物。

图12 活体大鼠脊髓的HOMOGENIZED谱

2.3 不均匀场下分子间单量子相干高分辨谱技术及其应用

2010年陈忠小组把分子间单量子相干 (intermolecular Single－Quantum Coherence，iSQC)信号应用到不均匀场中获得高分辨的NMR谱，［21］提出了新脉冲序列 (如图13)。该序列所得谱的表观J耦合常数和常规单量子相干(Single－Quantum Co-herence，SQC)谱的一致，而且新序列能很好地压制水峰，采样效率高并对脉冲角度的不准确性不敏感。

图13 基于iSQC的脉冲序列

图14a为猪脑组织和黄瓜样品的传统1D SQC谱，由于线宽为80Hz的不均匀场和强大的水峰信号不能分辨出任何有用的谱图信息，而b、c、d IDEAL－III的定域谱中不均匀线宽大大减小而且水峰也得到了有效压制。与非定域的猪脑组织［21］和黄瓜组织(图14e)的IDEAL－III谱图相比，在定域谱中也观测到了猪脑组织和黄瓜组织的主要代谢物谱峰。这说明IDEAL－III序列也能用于活体高分辨率定域谱。而且与常规PRESS谱(图14f－h)相比，其(图14b－d)能提供更多的谱图信息。织对应的IDEAL－III投影谱;(f－h)分别为 (b－d)中所对应定域区域的常规PRESS谱;右上方为该样品的自旋回波成像，黄瓜和猪脑组织的区域分别标为I和II。

图14 猪脑组织和黄瓜组织的1H MRS

该方法已应用于猪脑和黄瓜样品获得了高分辨率的体外MRS。2012陈忠小组又把图13(b)所示的空间定域方法应用于活体成年SD大鼠 (Sprague － Dawley rat，SD 大鼠)上，［22］并获得了高分辨率的NMR谱，这里不再详细介绍。

定域iSQC MRS在大体素中对场的不均性不敏感，所得谱的分辨率可与传统PRESS从均匀的小体素中得到谱的分辨率相比较。为相对大的体素，特别是活体研究，提供了一种获得高分辨率NMR谱的可选方法。总之，在活体和体外组织样品中IDEAL－III序列都具有一定的应用前景。

2.4 不均匀场下分子间双量子相干高分辨技术及其在人体小脑中的应用

与iZQC信号相比，获得纯的分子间双量子相干 (intermolecular Double－Quantum Coherence，iDQC)信号不需要额外的相位循环，而且iDQC信号强度比iZQC大约强30%。［23］2010年陈忠小组首次研究了在3T全身成像仪上获得活体高分辨定域iDQC谱的可行性，［24］图15为所采用的脉冲序列。

图15 带有PRESS定域模块的用于采集2D iDQC MRS的脉冲序列

Sinc脉冲用于体素选择、信号激发和重聚。高斯形脉冲选择性激发水峰。灰色矩形:破坏梯度;黒色矩形:片选梯度;斜线矩形:iDQC的相干选择梯度。

图16(b)为从20×20×20mm3的体素上获得的传统PRESS谱 (体素位置如图16a)，由于该体素位于右小脑的中心，磁场相对均匀，可以清楚的分辨出3个主要的代谢物谱峰。图16c为用于iDQC采样的体素，大小为40×40×80mm3覆盖了整个左右小脑，不仅包含了小脑组织，还包含了脑脊液和部分脑盖骨。图16d为与c相对应的高分辨率1D iDQC投影谱，与b具有类似的分辨率，NAA的线宽大约为6.0Hz。总实验时间约为6.5min，是临床上可以接受的时间范畴。这表明iDQC方法可以在不均匀场中获得高分辨率的活体谱图，而在这种情况下常规MRS技术并不适用。此外，脑模型和志愿者小脑的实验结果［24］均已表明在3－T临床成像仪上 MRS的研究中，可用iDQC信号在不均匀场中量化代谢物信号的比率，而且是一种比较可靠的方法。

图16 人体小脑的MRS

iDQC方法的优势在于其对不均匀场不敏感而且采样效率高，可以在数分钟内获得MRS。而且其从不均匀场大体素中获得的谱图和PRESS从均匀的小体素中获得的谱图分辨率类似。但iDQC谱的J耦合调制因子为3，对测量弱耦合自旋体系中的小J耦合常数有利，但会加剧强耦合体系中的谱峰重叠。在传统方法不适用的较大不均匀场下，iDQC方法是一个很好地补充。iDQC方法也许可以在不均匀的大体积脑组织中获得高分辨率的谱图，并对代谢物进行量化，提供某些疾病的代谢物标志物。

3 结束语

高分辨率的NMR谱技术能够为分子结构以及成分分析提供准确的化学位移、J耦合以及耦合裂分结构信息。但在很多情况下由于场的不均匀性，无法得到高分辨率的谱图。源于远程偶极相互作用的iMQC方法对磁场的不均匀性不敏感，可以在不均匀场下获得高分辨率的NMR谱。文章总结了多种iMQC方法并给出了它们在生物组织或活体中的应用实例。而且把iMQC方法和定域模块相结合在不均匀场下获得高分辨率的NMR谱。但是这些iMQC信号都是源于分子间的信号，其信号强度比传统的NMR谱信号弱。因此iMQC方法得到的高分辨率谱，SNR都比较低，可以说这些方法就是牺牲了SNR来提高谱图的分辨率。因此如何来提高iMQC谱的SNR具有重要意义，目前已经有研究小组把超极化技术［25］应用于iMQC的研究，或许这种方法能够用于iMQC谱来提高谱图的SNR。

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