甘草黄酮对紫外线照射无毛小鼠皮肤的防护作用①

陈东波，曾繁涛

(1.广东药学院基础学院，广东 广州 510006;2.深圳市第四人民医院药剂科，深圳 518033)

随着臭氧层日益变薄，到达地面的紫外线不断 增多。紫外线造成的皮肤光老化及相关疾病也随之

增加。紫外线长期照射，可致曝光部位皮肤色素沉着、粗糙、干燥、皱紋加深等。甘草为豆科植物光果甘草、乌拉尔甘草、胀果甘草的干燥根及根茎。其所含甘草黄酮类化合物为主要活性成份，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗溃疡、护肝等药理作用，其中的异甘草素还具有抗肿瘤作用。［1～2］目前，从各种甘草中分离出黄酮类化合物有150余种之多，表现有良好的抗氧化活性，可作为自由基清除剂，使正常细胞免受氧化损伤。［3］本研究观察皮肤外用甘草黄酮对紫外线照射引起的小鼠皮肤组织结构，SOD、GSH－Px、CAT、MDA、Hpy含量及Ⅰ型胶原蛋白mRNA的相对定量的影响，探讨甘草黄酮对紫外线照射无毛小鼠皮肤的防护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 选取昆明种健康小鼠40只 (广东药学院实验动物中心提供)，体重20～25g，雌性，随机分为4组，每组10只:正常对照组，模型组，基质组和甘草黄酮组。

1.2 甘草黄酮乳膏 取甘草黄酮 (由陕西华泰生物精细化工有限公司提供)及及乳剂基质 (液体石蜡、二甲硅油、白凡士林、丙二醇、甘油、乳化剂Einspire343、纯化水等)按乳剂常规制备工艺流程制成水包油型甘草黄酮外用乳膏，其中甘草黄酮含量为5%。

1.3 试剂 皮肤丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH －Px)及羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)检测试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品;总RNA提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供;Real time PCR相关试剂由大连宝生物工程有限公司提供;cDNA合成试剂盒为美国MBI公司产品。

1.4 主要仪器 UVA和UVB紫外灯管 (合肥赛帆试验设备有限公司，型号:UVA－340和UVB－313型);紫外－可见分光光度计 (日本岛津，型号:UA－240);光学显微镜 (奥林巴斯公司，型号:BX53型);实时荧光定量PCR仪 (德国耶拿分析仪器股份公司，型号:qTOWER型)。

1.5 紫外线照射与给药 将小鼠背毛剃净，面积2cm×2cm。除对照组外，各组小鼠于紫外灯下(UVA+UVB，模拟日光)照射，照射距离50cm，1h/d，每周5次，连续8周。紫外线照射20min前，基质组和甘草黄酮组小鼠于脱毛区分别定量均匀涂抹基质乳膏和甘草黄酮乳膏。

1.6 测定皮肤组织SOD、GSH－Px、CAT、MDA、Hpy含量 取紫外线照射部位皮肤全层1g，放置－80℃超低温冰箱保存备用。制备皮肤组织匀浆液，按试剂盒说明书要求操作，分别检测MDA、SOD、GSH－Px、CAT、Hyp水平。

1.7 测定Ⅰ型胶原蛋白mRNA的相对定量 以Trizol法提取皮肤组织总RNA，各总RNA样本吸光度A260/A280值均为1.8～2.0。放置－80℃超低温冰箱保存备用。用随机引物将各样品总RNA反转录为cDNA。取总RNA 2.0μg加入20μl反应体系中，依照2步反应法得到的cDNA(65℃5min 1个循环，42℃60min 1个循环)，于－20℃保存。依据Gen Bank相应的cDNA序列 (NM007743.2，NM007393.3)进行BLAST分析，然后应用Premier 5.0软件，设计内参照β－actin的引物和目的基因Ⅰ型胶原蛋白，于PCR仪上进行PCR扩增，同时扩增看家基因β－actin，校正加样误差。反应完成后计算基因表达量。

1.8 观察皮肤组织结构 取紫外线照射部位皮肤0.3cm×0.3cm，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片、HE染色。采用光学显微镜观察皮肤组织病理形态。

1.9 统计学方法 运用SPSS13.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差 ()表示，行方差分析和t检验。

2 结果

2.1 皮肤组织SOD、GSH－Px、CAT及MDA含量模型组与基质组比较，两组皮肤组织SOD、GSH－Px、CAT及MDA水平无明显差异 (P＞0.05);与对照组比较，模型组皮肤组织SOD、GSH－Px、CAT水平显著下降 (P＜0.01)，MDA水平显著升高(P＜0.01);与模型组及基质组比较，甘草黄酮组皮肤组织SOD、GSH－Px、CAT水平显著升高 (P＜0.01)，MDA水平显著下降 (P＜0.01)，见表1。

表1 小鼠皮肤组织SOD、GSH－Px、CAT及MDA含量比较 (n=10，x ±s，μmol/g Pro)

2.2 皮肤组织Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量 模型组与基质组比较，两组皮肤组织Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白相对含量无明显差异 (P＞0.05);与对照组比较，模型组皮肤组织Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白相对含量显著下降 (P＜0.01);与模型组及基质组比较，甘草黄酮组皮肤组织Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白相对含量显著升高 (P＜0.01)，见表2。

表2 小鼠皮肤组织Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量 (n=10，)

表2 小鼠皮肤组织Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量 (n=10，)

组别 Hyp(mg/g) Ⅰ型胶原蛋白相对含量对照组 3.37±0.581) 1.104±0.1251)模型组 2.46±0.41 0.548±0.062基质组 2.54±0.47 0.581±0.069甘草黄酮组 3.15±0.561)2) 0.816±0.1071)2)

2.3 皮肤组织结构 光学显微镜(10×40)下观察显示，模型组和基质组表皮明显增厚，组织结构不完整，纤维组织排列紊乱，出现断裂现象，可见炎性细胞浸润，皮脂腺不规则增生。对照组和甘草黄酮组角质层薄，表皮组织结构完整，各层细胞清晰，真皮层纤维组织呈波浪状均匀分布，见图1～4。

图1 模型组HE染色，10×40

图2 基质组HE染色，10×40

图3 对照组HE染色，10×40

图4 甘草黄酮组HE染色，10×40

3 讨论

紫外线中的UVA和UVB波段是人体皮肤产生光老化的重要影响因子，紫外线辐射可增加氧自由基的生成，造成组织抗氧化能力降低，最终导致皮肤组织老化，这成为皮肤衰老的重要原因。［4］自由基可诱发生物膜不饱和脂肪酸—花生四烯酸过氧化，生成MDA等脂质过氧化物的代谢物，其含量的升高可反映皮肤损伤程度的增加。SOD、CAT、GSH－Px等抗氧化活性酶物质可以调节皮肤自由基的产生，清除多余的氧自由基，避免过早的皮肤衰老。本实验结果显示，紫外线辐射后，模型组小鼠皮肤组织中MDA水平较对照组显著升高 (P＜0.01)，而皮肤组织中SOD、GSH－Px、CAT水平显著下降 (P＜0.01);甘草黄酮组皮肤组织中MDA水平较模型组及基质组显著下降 (P＜0.01)，而皮肤组织中SOD、GSH－Px、CAT水平显著升高 (P＜0.01)。

胶原纤维是真皮中的重要成分，主要为胶原蛋白，其含量会随年龄的增长而明显下降，从而导致皮肤弹性下降，皮肤松弛，因此，胶原含量的变化反映皮肤老化的程度。I型胶原蛋白是皮肤胶原蛋白的重要组成成分，紫外线辐射可影响其形成，从而导致成熟胶原束减少，皮肤出现松弛和皱纹。紫外线不仅可以使真皮中成熟胶原减少，［5－6］还可以下调Ⅰ型前胶原基因表达，损害新生胶原的生物合成，［7］使皮肤胶原蛋白减少。Hyp是真皮内含量稳定的氨基酸，其含量直接反映出真皮内胶原纤维的含量变化，从而提示真皮衰老的程度。皮肤组织中Hyp含量变化是判定皮肤衰老程度的敏感指标。［8］本实验结果显示，紫外线辐射后，模型组小鼠皮肤组织中Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白相对含量较对照组显著下降 (P＜0.01);甘草黄酮组皮肤组织中Hyp含量与Ⅰ型胶原蛋白相对含量较模型组及基质组显著升高 (P＜0.01)。

综上所述，甘草黄酮能够提高紫外线辐射皮肤的抗氧化能力，加快清除氧自由基，并调节紫外线辐射后皮肤组织氨基酸代谢，增加皮肤胶原蛋白的含量，从而对紫外线照射无毛小鼠皮肤发挥防护作用，延缓皮肤光老化。

［1］ KANAZAWA M，SATOMI Y，MIZUTANI Y，et al.Isoliquiritigenin inhibits the growth of prostate cancer［J］.Eur Urol.2003，43(5):580 －586

［2］ AMAROWICZ RR，PEGG B，RAHIMI－ MOGHADDAM P，et al.Free－radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies［J］.Food Chem，2004，84(4):551 －562

［3］ LEE SE，HWANG HJ，HA JS，et al.Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity［J］.life Sci，2003，73(2):167－179

［4］刘晓瑞.皮肤衰老和氧自由基理论［J］.生物学教学，2004，29(6):4 －5

［5］ Scharffetter KK，Brenneisen P，Wenk J，et al.Photoaging of the skin from phenotype to mechanisms［J］.Exp Gerontol，2000，35:307 －316

［6］周亚莉，闫建国，王晶晶，等.久效磷对大鼠皮肤成纤维细胞胶原Ⅰ和ⅢmRNA表达的影响［J］.环境与健康杂志，2011，28(9):785 －787

［7］ Fisher GJ，Datta S，Wang Z，et al.C － Jun － dependent inhibition of cutaneous procollagen transcription following ultraviolet irradiation is reversed by all－trans retinoic acid［J］.J Clin Invest，2000，106:663 － 670

［8］王红丽，吴铁，吴志华，等.丹参酮和维生素E抗皮肤衰老作用的比较研究［J］.中国老年学杂志，2003，23(12):861－821