柯尔克孜族和维吾尔族ACE基因多态性与2型糖尿病的关联研究∗

祖克拉·肉孜，吐尔逊·买买提，宋曼殳，多力坤·买买提玉素甫†

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046；2.新疆阿克苏职业技术学院医学系，新疆阿克苏843000；3.首都医科大学公共卫生与家庭医学学院，北京100069)

肾素-血管紧张素（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）系统可通过不同机制参与糖尿病及其并发症的发生.自1990年Hubert[1]发现人ACE基因16内含子存在插入(I)/缺失(D)多态性，ACE基因多态性与各种疾病的关系受到广泛关注，针对不同民族人群的研究结论不尽相同[2,3].不同人种的生活环境及进化过程存在的差异，直接影响了易感基因的频率、连锁不平衡的情况及其在特定人群中作用的大小，因而在不同人群中进行关联研究，有望揭示该人群真正的致病位点.回顾我国近年来有关ACE基因多态性与2型糖尿病关联研究，以经济较为发达的东南沿海地区的汉族人群为主[4,5].新疆地区ACE基因多态性及其与高血压、冠心病的关系已有报道[6,7]，但未见其与2型糖尿病的关联研究.本研究探讨ACE基因I/D多态性在南疆地区2个少数民族人群中的分布情况及其与T2DM遗传易感性的关系.

糖调节受损是最重要的2型糖尿病高危人群，1995∼1997年调查结果显示，我国IGT(impaired glucose tolerance,IGT)标化患病率为4.76%，约为糖尿病标化患病率的1.5倍[8]，每年有1.5%～10%的IGT患者进展为2型糖尿病[9].2型糖尿病的病理过程各阶段间尚无明确的分界标志，IGT是公认的T2DM前期病变，5∼10年后约25%∼48%发展为临床糖尿病，可近似认为两者是同一疾病的不同发展阶段，具有同质性.较低水平表型涉及的基因或变异相对少，适当应用中间表型如空腹血糖水平、空腹胰岛素水平，理论上可以增加发现疾病易感基因的机会[10,11].目前的关联研究多以2型糖尿病患者与血糖正常人群为研究对象，鲜有IGT人群.本研究除2型糖尿病患者与正常血糖人群外，同时纳入了糖耐量减低人群.

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究于2012年7月∼2013年8月分别自和田民丰县人民医院和阿图什哈拉峻乡人民医院采集无血缘关系、年龄性别匹配的维吾尔族127例、柯尔克孜族117例样本.按照1999年WHO公布的糖尿病新诊断标准（①糖尿病症状，②空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≥7.0 mmol/L或③餐后2h血糖≥11.1mmol/L或③随机血糖≥11.1mmol/；无糖尿病症状者，需另日复查血糖）及糖代谢分类（正常血糖：餐后2h血糖＜7.8mmol/L；糖耐量减低(impaired glucose tolerance,IGT)：餐后2h血糖7.8∼11.1mmol/L）将研究对象分为正常糖耐量组(normal glucose tolerance,NGT)、糖耐量减低组及2型糖尿病组.通过临床特征及家族史排除青年发病的成年型糖尿病、母系遗传的糖尿病及妊娠性糖尿病、线粒体糖尿病、1型糖尿病、高血压、冠心病等其它明显器质性疾病.

要求所有调查对象均在所在地区居住三代以上，无血缘关系，年龄>20岁，家庭婚姻史为世代族内通婚.自肘静脉采血3mL加0.5mLACD抗凝，充分混匀后放入-20◦冰箱冷藏室保存待检.

按统一调查表进行直接问卷调查.对调查对象进行详细询问按项目内容逐项填写，力求调查表完整不缺项：电话、年龄、性别、身高、体重、腰围、臀围、血压、心率、吸烟史、饮酒史、家族史等.上述调查和取样均征得受试者本人同意并签署知情同意书.

1.2 主要试剂和仪器

PCR引物由上海生工公司合成，引物C1序列为5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’，引物B1序列为5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’.DNA Ladder购于宝生物工程大连有限公司，100mmol/L dNTPs(含Mg2+)、2U/µL Taq DNA聚合酶均购于北京鼎国生物技术有限责任公司.所用试剂均为进口或国产分析纯.基因扩增仪（美国），电泳仪和M-15E紫外图像分析系统（美国），高速冷冻离心机（德国）.

1.3 基因组DNA的提取

取冷藏保存的抗凝全血0.5mL注入1.5mL离心管P中，加双蒸水震荡使红细胞破裂，15 000r/min，留取白色沉淀，用酚-氯仿-异戊醇法提取DNA：取50µL WBC加入600µL TES充分颠倒混匀；37◦C水浴过夜；加入等体积酚(700µL)，颠倒混匀2 min，10 000r/min，离心5 min,取上清液；重复上述步骤.加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，颠倒混匀2 min后，10 000 r/min,离心5 min，取上清液.再加入2倍体积的冷无水乙醇(-20◦C冰箱中储存的)颠倒混匀，置-20◦C冰箱沉淀30 min以上.12 000r/min，离心20 min(4◦C)，弃上清.加入750mL/L乙醚1mL小心洗涤沉淀（颠倒混匀），12 000 r/min，离心10 min(4◦C)，弃上清.静置10∼20 min，待管壁残留的乙醇挥发干净后，将沉淀溶于50µL去离子水中即得DNA溶液，-20◦C保存备用.

1.4 ACE D/I基因多态性检测

1.4.1 PCR扩增

25µL的PCR反应体系中含有100 ng基因组DNA、10×PCR buffer为2.5µL,4×dNTP(10 mmol/L)为2.5µL,MgCI2(25 mmol/L)为1.5µL,引物C1和B1各10 pmol/L，1 U Taq DNA聚合酶,加去离子水补至终体积25µL.PCR扩增条件为94◦C 5 min 预变性，循环次数为35个（94◦C 1 min 变性，56◦C 1 min 退火，72◦C 1 min 延伸），72◦C 10 min最后延伸，4◦C保存.

1.4.2 基因分型

取PCR扩增产物5µL，2%琼脂糖凝胶电泳，100V，30 min，溴乙锭(EB)染色后，用UVI凝胶成像分析仪记录结果.

1.5 统计学分析

首先运用基因计数法计算两组基因型和等位基因频率，运用Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性(检验水准为P=0.05).组间等位基因频率和基因型频率比较采用卡方检验.三组间计量资料的比较采用方差分析法，全部数据采用SPSSl7.0软件进行统计分析，结果以P<0.05为差异有统计学意义.采用Logistic回归分析，用比值比（OR）和95%置信区间（95%CI）表示不同基因型与临床表型相关性强度.

2 结果

2.1 样品DNA的提取

将PCR扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳，与标准Marker对照得到3种基因型：II型(插入纯合子，只含490bp片段),DD型(缺失纯合子，只含190bp片段),ID型(缺失与插入杂合子，含490bp和190bp两片段)(见图1).先对所调查人群的基因型及等位基因频率进行分析，确认符合Hardy-Weinberg平衡.

图1 维吾尔族ACE基因PCR扩增产物

2.2 2型糖尿病组、糖耐量异常组及正常糖耐量组一般临床特征比较

比较三组的性别构成、年龄、体重指数、腰臀比(见表1，表2).

表2 柯尔克孜族3组临床特征比较

2.3 2型糖尿病组、糖耐量异常组、正常糖耐量组ACE基因型及等位基因频率分布

经Hardy-Weinberg平衡定律检验，ACE基因多态性的基因型及等位基因频率分布在病例组和对照组达到遗传平衡(P>0.05)，表明该研究对象来自大的群体，个体间为随机婚配，无明显的自然选择、迁移等因素对遗传平衡的影响吻合度好，资料代表性好.（见表3，表4）

表3 维吾尔族3组间AEC基因型和基因频率分布(%)

表4 柯尔克孜族3组间AEC基因型和基因频率分布(%)

2.4 糖调节异常组（T2DM+IGT）与正常糖耐量组（NGT）基因型及等位基因频率分布比较

分别合并两个少数民族T2DM与糖耐量减低组为糖代谢异常组，与糖耐量正常组的等位基因和基因型频率比较采用x2检验.（见表5，表6）

表5 维吾尔族2组间的ACE基因和多态性分析

表6 柯尔克孜族2组间的ACE基因和多态性分析

2.5 2型糖尿病风险因素分析

表7 维吾尔族和柯尔克孜族糖代谢异常组与NGT组ACE基因多态性风险度分析

将单因素分析中与2型糖尿病有关的指标通过Logistic回归进行分析.经风险度分析发现，在维吾尔族T2DM组中携带DD、ID、ID+DD基因型发生的个体较携带II基因型的个体发生糖代谢异常（T2DM+IGT）的危险性增加(OR=7.812，95%CI=3.135-19.607;OR=4.854，95%CI=1.835-12.821;OR=6.410，95%CI=2.865-14.286)，携带D等位基因的个体较携带I等位基因的个体发生糖代谢异常（T2DM+IGT）的危险性增加（OR=4.444，95%CI=2.617-7.576)，而柯尔克孜族DD、ID+DD基因型和D等位基因性对糖代谢异常（T2DM+IGT）的发病风险降低（见表7）.

3 讨论

近年来，关于ACE基因多态性与糖尿病关系的研究报道日趋多见，但其结论差异很大.在非洲和欧洲人群中研究发现ACE基因多态性与糖尿病有关联[12,13]，而在亚洲人中则无关联[14−18].表明ACE基因多态性与糖尿病的关系存在着种族或民族差异，这就要求在探讨ACE基因多态性与糖尿病关系时，应在不同种族或民族间进行.我国新疆少数民族人群与外界相对隔离，极少与外族通婚，遗传背景较为一致，是我国特有的隔离人群遗传资源；新疆的许多少数民族（如维吾尔族、柯尔克孜族、塔吉克族、哈萨克族等）素有高脂肪、高蛋白饮食的习惯，有较高的糖脂代谢紊乱的患病率，是研究糖尿病相关的民族特异性潜在生物标志物的宝贵人群资源.本研究选取新疆地区维吾尔族、柯尔克孜族糖耐量正常人群、糖耐量减低人群及2型糖尿病患者为研究对象.单因素分析结果显示：同一民族病例组（T2DM与IGT）与对照组年龄、BMI、WHR情况差异具有统计学意义；T2DM组与IGT组的差异大多不具有统计学意义，合并此两组为糖代谢异常组.合并前后，ACE基因多态性的组间差异均具有统计学意义.logistic回归分析结果表明，DD基因型（D等位基因）可能是南疆（和田民丰）维吾尔族患2型糖尿病的危险因素，柯尔克孜族的保护因素.ACE基因多态性可能与2型糖尿病患病有关，同一等位基因不同民族间致病机制可能不同.