壳聚糖基水凝胶药物控制释放体系

曾 敬，康艳红，田 鹏，苏桂田

（沈阳师范大学 化学与生命科学学院，沈阳 110034）

0 引 言

水凝胶合成材料的多样性使人们能更加灵活地设计出具有不同特性的药物控制释放体系。天然高分子材料，如多糖和蛋白，由于其良好的生物相容性、低毒性、对酶的易感性，在用作制备水凝胶的材料方面，引起了人们广泛的兴趣。在这些高分子中，多糖还具有其独特的优点，如无免疫原性、无传播动物源病菌的潜在危险性等。其中的一个多糖就是壳聚糖。壳聚糖具有其他天然高分子材料的优点，又不会引发免疫反应。

壳聚糖不同于其他多糖，其分子结构中存在氨基，可被质子化，能形成聚电解质络合物。壳聚糖无毒、稳定、可生物降解、杀菌，在生物医学和生物技术领域有广泛的应用［1］，使之成为药物控制释放领域中的理想载体。

通过物理交联或化学交联，壳聚糖可制成包括液体凝胶、粉末、颗粒、薄膜、片剂、胶囊、微球、微粒、纱布、纳米纤维及无机共混物等各种形状、各种尺寸的水凝胶剂型。

1 物理作用的网络结构

1.1 离子络合物

由于壳聚糖氨基正离子的存在，使壳聚糖与带负电荷的分子之间可发生离子相互作用，形成离子络合物，如带负离子的小分子硫酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐，金属负离子如Pt（Ⅱ）、Pd（Ⅲ）、Mo（Ⅵ）。通过调整电荷密度、阴离子的尺寸以及调整壳聚糖的脱乙酰度和密度，可制备出各种不同性能的水凝胶材料。

带负离子的小分子与壳聚糖的结合都是通过壳聚糖质子化的氨基，而金属离子与壳聚糖间的结合是通过配位共价键而非静电作用。这种配位共价键的作用要强于静电吸引作用。另外，金属阴离子的电荷密度由pH值决定，而壳聚糖及一些小分子的球电荷密度则既受pH值影响，也受材料本身的pKa值决定。壳聚糖在pH 6以上时，就几乎不带电荷，这大大限制了其形成离子络合物的能力，进而限制了其在生理条件下的应用。同样，阴离子分子应具有高电荷密度，以形成强有力的静电作用，同时，分子量要小，以利于其自由地在高分子网络结构中扩散进而发生静电作用。

1.2 物理混合物和次级作用力

除了前面介绍的通过几种特定的物理相互作用形成水凝胶之外，还可通过将壳聚糖与其他水溶性非离子型高分子（如PVA）共混获得。这些高分子混合物在冻干后或若干冷冻－解冻循环后形成微晶或络合结点，即水凝胶的交联点。对于壳聚糖－PVA共混物，如增加壳聚糖含量则会削弱PVA形成微晶的能力，增加所形成水凝胶的无序性。

最近，一种新型的壳聚糖与聚乙烯亚胺（PEI）共混的水凝胶被制备出来［2］。PEI是阳离子聚合物，可广泛地用作基因转染试剂。通过与壳聚糖共混，一种3D水凝胶5min就可制备出来。这种水凝胶在细胞培养条件下性质稳定，可支撑人体胎儿骨骼细胞的生长。如果制备水凝胶时pH 7.5，则壳聚糖是不溶的，可能导致链间形成结晶。即使不加任何其他高分子材料或络合物，壳聚糖自身也能形成水凝胶。Ladet等通过凝胶形成的氢醇法对此进行了解释［3］。氢醇法中，用氢氧化钠溶液处理壳聚糖以使壳聚糖上的氨基游离出来，这样就避免了高分子链间的离子排斥力，就可能形成氢键、疏水相互作用、壳聚糖结晶等。通过这种技术可制备出立方厘米尺寸的水凝胶。如果在制备过程中降低溶液的碱性，则凝胶尺寸大幅减小，随着碱性的进一步降低，凝胶的损耗程度也增加。有趣的是，通过间歇凝胶法可制备多层洋葱样水凝胶（如图1），可用于在多种治疗手段中或脉冲式给药中实现对多种药物的共担载［4］。

图1 多层洋葱样水凝胶［4］

1.3 热可逆水凝胶和疏水缔合作用

研究者打造了一系列被称作热可逆凝胶的水凝胶体系，根据环境温度的不同可呈现瞬时凝胶态或液体状态。这些高分子通过疏水相互作用或次级作用力在链间形成结点，从而在可流动性液体溶液中形成一个半刚性的水凝胶。特殊的是当系统达到一个较低的临界温度（LCST）值时，材料会发生亲水－疏水性互变现象。在室温条件下具有较低浓度的高分子溶液，当温度高于LCST值时就会形成凝胶，这种性能在材料的生物医学应用方面是极其重要的。这些材料可以以液体的形式注入人体，当人体某个部位温度高于LCST时，就在原处形成凝胶，这样可望成为生物医药领域的一种新型载体［5］。这些可注射的凝胶体系可通过外科手术进入体内，可传递生物活性物质到达病灶部位而无明显的副反应（如局部过热、有机溶剂的作用、毒副产物的形成等）。在临床使用中，可注射的水凝胶特别适用于治疗一些形状不规则的病灶，而不用对传统支架结构进行设计和修整。

甘油磷酸二钠盐（GP）和壳聚糖物理共混物有对湿度敏感的性质。GP中的磷酸盐部分有中和壳聚糖中氨基的作用，从而在温度升高的过程中可增强壳聚糖的疏水性和壳聚糖链间氢键的形成。室温下该混合物为一澄清的液体，在37℃时变成凝胶［6］。壳聚糖／GP凝胶可传递生物活性骨蛋白，还可以作为软骨细胞的担载基质，三周后可在活体内生长出正常的软骨组织。

Bhattarai等利用壳聚糖链间的相互作用，以Schiff碱和氰基硼氢化钠为催化剂化学接枝单羟基PEG到壳聚糖骨架上，也制备出了可注射的温度可逆凝胶［7］。优化PEG用量（45%～55%）和PEG MW（即亲水和疏水基团的比例平衡），共聚物表现出温度可逆互变特性，在室温条件下为可注射液体，在体温条件下变成凝胶。因此，可在低于溶胶－凝胶转变温度下用注射器注射，当高于溶胶－凝胶转变温度时，溶液转变成透明凝胶。在低温下，PEG主要与水分子形成氢键，较高温度时，则主要是与高分子链间的疏水相互作用占主导。这种亲水／疏水特性的转变导致了凝胶的形成。

2 化学交联的网络结构

尽管物理交联的水凝胶有一系列优点，但同时也存在局限性，物理凝胶的孔隙尺寸、化学行为、降解或溶解行为在体内都很难控制。

为避免上述缺陷，可制备壳聚糖不可逆网络结构水凝胶。这些水凝胶的高分子链都是通过小分子交联剂或二次聚合等作用共价键合在一起的。化学交联水凝胶的性质主要受交联密度及交联剂与高分子结构重复单元的摩尔比的影响。下面分别介绍不可逆壳聚糖基水凝胶的不同形成方式。

2.1 小分子交联剂

许多双官能团的小分子都可被用作壳聚糖的交联剂，包括戊二醛、二缩水甘油醚、二异氰酸酯、二丙烯酸酯等。与物理凝胶相比，这些化学交联凝胶的机械性能明显提高。但是许多交联剂的生物相容性还不清楚，很多交联剂还发现具有相对的生物毒性。为了防止痕迹量未反应的交联剂在体内造成的影响，化学交联的水凝胶在使用前必须进行严格的纯化。另外，有些交联剂还会与水凝胶担载物反应，限制了所担载物质的释放。目前，可供选择的安全的、生物相容性好的共价交联剂十分有限，这也是共价交联水凝胶的主要缺点。

由桅子中提取出的京尼平（genipin）是一种纯天然的新型交联剂，具有良好的生物相容性［8］，可有效共价交联壳聚糖和明胶等含有氨基的高分子，与戊二醛相比具有较少的细胞毒性。而且，用京尼平交联的壳聚糖比用戊二醛交联的壳聚糖降解速率更慢。另外，用京尼平交联的壳聚糖也表现出更长的药物释放时间。尽管京尼平具有良好的生物相容性，但其还是易与所担载药物发生反应，这也是京尼平在药物控制释放领域的应用中所需要考虑的一个问题。

2.2 高分子－高分子交联

为了避免在制备水凝胶的过程中使用交联剂，研究人员事先将高分子链功能化，使其带有可反应的官能团，然后在原位共价交联形成水凝胶。依据交联反应速度及所选择要发生反应的官能团，则可以形成不同类型的共价交联点。

在生理pH值下，将N－琥珀酰化的壳聚糖与醛基为终端的透明质酸混合在一起1～4min，就可以生成Schiff碱［9］，反应条件温和，生成的水凝胶可至少在4W时间内保持稳定，并且可担载软骨细胞。

通过迈克尔加成反应也可使高分子链间交联，形成水凝胶。如，壳聚糖的氨基作为亲核试剂与其他高分子链上的乙烯基进行反应。这种方法的反应速率快，在反应中能形成不同类型的共价键，与生物分子的反应相对温和，因此目前很流行［10］。用丙烯酸酰化的壳聚糖与硫醇化的PEO反应，制备出了壳聚糖－PEO水凝胶［11］。研究表明，利用活性硫醇及通过迈克尔加成反应制备的高分子具有明显的黏附性，在对口腔的药物缓释治疗方面提供了支持。

2.3 光交联

高分子可利用对光敏感的官能团进行交联形成水凝胶。这种技术具有制备方法简单、反应速率快、安全性高、成本低等优点，而传统的化学交联法则往往需要加入一些活性物种、引发剂或催化剂等。

通过将壳聚糖链上引入功能基团叠氮基，可实现原位光敏交联获得壳聚糖水凝胶。紫外光照射后，叠氮基转化成氮宾基，与壳聚糖上的游离氨基反应成键，60s内就可形成水凝胶。这种壳聚糖水凝胶能够控制多种生长因子的释放速率，是一种新型的生长因子载体，可以在体内诱导新血管的形成［12］。

通过光交联，还可制备热敏性壳聚糖－聚醚水凝胶。用丙烯酸酯将壳聚糖功能化后再和聚醚混合，然后用UV照射可发生交联。壳聚糖－聚醚水凝胶对包埋的人体生长因子hGH和质粒DNA均表现出持续的释放性能［13－14］。

2.4 酶交联

光敏交联高分子水凝胶可在原位形成，有许多优势，但也存在缺点，如交联需要一定的光敏剂和一定的辐射时间。这可能导致机体局部温度升高，进而损伤邻近的细胞和组织。用酶催化高分子交联是一种温和的新方法。这项技术在组织工程支架、药物或蛋白的传递等生物医药领域已显示出很大的应用前景。辣根过氧化酶（HRP）是一种单链β－型血红素蛋白，通过氢过氧化物的分解，可催化酚或苯胺衍生物的偶合，起到交联作用［15］。

近年来，Jin等利用乙醇酸接枝的水溶性壳聚糖和根皮酸（PA）在辣根过氧化酶和过氧化氢催化下进行交联，制备了一种可注射的壳聚糖基水凝胶［16］。控制高分子的浓度为1%～3%，可使凝胶形成时间控制在10s～4min。通过改变初始高分子的浓度，可有效调节水凝胶的凝胶含量、吸水性、酶降解时间及机械性能。酪氨酸酶是动物和植物组织内的一种氧化酶，可用来交联壳聚糖和明胶，在原位形成水凝胶。酪氨酸酶氧化明胶的酪氨酰残基，形成醌残基，与壳聚糖的氨基作用，形成分子间的交联点。壳聚糖和明胶的交联在30min内，适于凝胶的原位应用。

3 药物的担载

作为药物载体的水凝胶，其药物担载和释放性能一方面取决于水凝胶的物理和化学性质，另一方面也取决于治疗本身。实际上，水凝胶材料的选择、网络结构的形成、药物担载的机理都应充分考虑，以弥补药物本身性质的不足（如脂溶性、带电荷等）及药物作用机理的不足（如释放速率是否太快、药物是否是高度裸露等）。药物的担载主要有3种方法：扩散、包埋、栓系。每种方法都有自己的优点和缺点，选择哪种方法应充分考虑所使用的水凝胶的特性及所担载药物的特性。

最简单的药物担载方法是将充分形成的水凝胶置入被药物所饱和的介质中［17］。依据水凝胶孔径的大小、药物的尺寸及它们的化学性质，药物分子会缓慢扩散至水凝胶中。当水凝胶置入体内，药物会自由扩散出水凝胶，进入邻近组织。这种方法对小分子药物的担载十分有效，但像多肽、蛋白这样的大分子药物，则不易在水凝胶的小孔隙中移动。而且，这种方法进行的药物担载也需耗费很长的时间。对于较大的药物分子，则须将药物与高分子溶液混合，然后再加交联剂进行交联，在凝胶化过程中将药物分子包埋其中。需要注意的是，必须充分考虑药物分子的化学性质，避免不必要的交联及药物活性的降低。

无论是扩散方法还是包埋方法，药物分子都可以自由从凝胶网络结构中出来。凝胶置入体内后，由于凝胶与周围药物浓度的差异，会导致置入前期药物的突释。为了尽可能地减少所担载药物的损失及机体中毒的可能，可在凝胶化前将药物分子共价键合到高分子链上或以物理方法连接到高分子链上。当水凝胶分解或药物分子与高分子间的价键断裂时，药物分子才会释放出来，起到治疗作用。药物与高分子间的连接易受周围环境中酶的影响，可以此来控制药物的释放速率和释放时间。

分子之间如果溶解性不同，或带有相同的电荷，那么在进行药物担载时也是很难处理的。如，像紫杉醇这样的疏水分子，必须在制备水凝胶前，将其与两亲性添加物混合，然后在溶液中共混进行担载。Jauhari等将紫杉醇与柠檬酸甘油单酯共混，然后再凝胶化，实现了对紫杉醇的担载［18］。

4 药物的释放

水凝胶所担载的药物的释放可通过3种不同的方式进行：扩散方式、化学／环境应答方式及特定酶的应答方式。药物的扩散释放可通过调整药物分子在高分子基质间的运动或调整水凝胶在体内的分解速率来调控。具有环境应答功能的水凝胶会根据周围pH和温度条件的不同，有效膨胀扩张其孔径，从而在所设定的条件下提高所包埋药物的扩散速率。这种药物控制释放模式可在治疗部位保持有效的药物水平，并避免药物在病灶以外的部位发生释放。

通过扩散进行的局部药物控制释放是一种最基本的非特异性的控制释放方式，而化学或生物环境刺激引起的药物释放则更具有可调控性和可选择性，可避免药物在到达病灶部位前与大量健康组织发生相互作用。这一点是十分重要的。

环境应答或酶应答诱发水凝胶发生3种变化：膨胀、分解或降解，从而有利于药物的释放。水凝胶的膨胀使网络结构中的孔径增大，使水凝胶中包埋的药物可以以更快的速度扩散出来。而分解或降解则是水凝胶的物理解体。当高分子链间的交联点或结合的分子断裂时，即水凝胶发生分解，药物就释放出来。

5 展 望

由于交联机理的发展，新的材料的出现，水凝胶的种类也发展得越来越多。这些凝胶具有孔径、机械强度和尺寸可调性，以应用于不同领域。壳聚糖更是由于其独特的阳离子特性，及在体内的降解机理而在水凝胶领域中占有相当重要一席。

壳聚糖是智能药物控制释放领域中最主要的一员，可在注射药物控制释放体系、肿瘤治疗的原位凝胶体系、组织再生、口腔药物传递等领域都受到了强烈的关注。

可以预见，当进一步掌握壳聚糖基网络结构的动力学后，还会产生新一代的药物传递体系。便宜、无毒、有效的壳聚糖基水凝胶药物控制释放体系会与临床应用越来越近。

［1］曾敬，赵桂贞，段纪东，等.天然高分子材料甲壳素和壳聚糖及其衍生物［J］.沈阳师范大学学报：自然科学版，2006，24（3）：325－329.

［2］KHAN F，TARE R S，OREFFO R O C，et al.Versatile biocompatible polymer hydrogels：scaffolds for cell growth［J］.Angew Chem Int Ed，2009，48：978－982.

［3］LADET S，DAVID L，DOMARD A.Multi－membrane hydrogels［J］.Nature，2008，452：76－79.

［4］CHEN R R，SILVA E A，YUEN W W，et al.Integrated approach to designing growth factor delivery systems［J］.FASEB J，2007，21：3896－3903.

［5］KRETLOW J D，KLOUDA L，MIKOS A G.Injectable matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering［J］.Adv Drug Deliv Rev，2007，59：263－273.

［6］CHENITE A，CHAPUT C，WANG D，et al.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ［J］.Biomaterials，2000，21：2155－2161.

［7］BHATTARAI N，RAMAY H R，GUNN J，et al.PEG－grafted chitosan as an injectable thermosensitive hydrogel for sustained protein release［J］.J Control Release，2005，103：609－624.

［8］JIN J，SONG M，HOURSTON D J.Novel chitosan－based films cross－linked by genipin with improved physical properties［J］.Biomacromolecules，2004，5：162－168.

［9］TAN H，CHU C R，PAYNE K A，et al.Injectable in situ forming biodegradable chitosan－hyaluronic acid based hydrogels for cartilage tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30：2499－2506.

［10］METTERS A，HUBBELL J.Network formation and degradation behavior of hydrogels formed by Michael－type addition reactions［J］.Biomacromolecules，2006，7：290－301.

［11］KIM M S，CHOI Y J，NOH I，et al.Synthesis and characterization of in sytu chitosan－based hydrogel via grafting of carboxyethyl acrylate［J］.J Biomed Mater Res，A 2007，83：674－682.

［12］ISHIHARA M，OBARA K，ISHIZUKA T，et al.Controlled release of fibroblast growth factors and heparin from photocrosslinked chitosan hydrogels and subsequent effect on in vivo vascularization［J］.J Biomed Mater Res，Part A，2003，64A（3）：551－559.

［13］YOO H S.Photo－cross－linkable and thermo－responsive hydrogels containing chitosan and pluronic for sustained release of human growth hormone（hGH）［J］.J Biomater Sci Polym Ed，2007，18：1429－1441.

［14］LEE J I，KIM H S，YOO H S.DNA nanogels composed of chitosan and Pluronic with thermo－sensitive and photocrosslinking properties［J］.Int J Pharm，2009，373：93－99.

［15］SAKAI S，YAMADA Y，ZENKE T，et al.Novel chitosan derivative soluble at neutral pH and in－situ gellable via peroxidase－catalyzed enzymatic reaction［J］.J Mater Chem，2009，19：230－235.

［16］JIN R，MOREIRA TEIXEIRA L S，DIJKSTRA P J，et al.Injectable chitosan－based hydrogels for cartilage tissue engineering［J］.Biomaterials，2009，30：2544－2551.

［17］SOKKER H H，GHAFFAR A M A，GAD Y H，et al.Synthesis and characterization of hydrogels based on gfafted chitosan for the controlled drug release［J］.Carbohydr Polym，2009，75：222－229.

［18］JARHARI S，DASH A K.A mucoadhesive in situ gel delivery system for paclitaxel［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2006，7：E154－E159.