一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选方法

吴凤麟，韦嘉灝，贾筠，何免，邵红伟，黄树林



一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选方法

吴凤麟，韦嘉灝，贾筠，何免，邵红伟，黄树林

510006 广州，广东药学院生命科学与生物制药学院（吴凤麟、韦嘉灝、何免、邵红伟、黄树林），生物制药研究所（吴凤麟、邵红伟、黄树林），广东省生物技术候选药物研究重点实验室（吴凤麟、邵红伟、黄树林）；523059 东莞市人民医院肿瘤内科（贾筠）

Wolfl 等[1]的研究建立了一种以 CD137 为表面标记，从人 CD8+T 细胞中快速鉴定和分离抗原特异性 T 细胞的方法。由于 CD137 分子表达于活化的 CD4+和 CD8+T 细胞表面[2]，其表达上调依赖于 T 细胞经抗原刺激后活化，并可在抗原刺激后 12 h ~ 5 d 内持续表达[3]。因此可以 CD137 为标记，从 T 细胞中检测和分离比例较低的抗原特异性 T 细胞。

上述研究主要从健康人外周血单核细胞（peripheral blood monocyte，PBMC）中筛选 CD137+抗原特异性 T 细胞。然而由于成熟的外周血 T 细胞经历了胸腺的阴性选择，其 T 细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）对自身抗原肽（接近肿瘤抗原肽）/MHC 复合物的亲和力低下[4]，限制了以健康人 PBMC 筛选肿瘤抗原特异性 T 细胞的效率。因此，有必要寻找更理想的肿瘤抗原特异性 T 细胞筛选来源，这一来源应较为确定地含有可识别肿瘤相关抗原的 T 细胞亚群。

国外临床研究结果提示，肿瘤局部浸润的记忆性 T 细胞数量，与患者的预后和转归有明显相关性[5]。提示肿瘤浸润记忆性 T 细胞可在局部识别肿瘤抗原进而发挥抗肿瘤免疫效应。尤其是记忆性 T 细胞中的中枢型记忆性 T 细胞（central memory T cell，TCM）亚群可在体内长期存活，并保持其抗原特异性[6]。因此，来源于肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中的记忆性 T 细胞，特别是 TCM有望为肿瘤抗原特异性 T 细胞提供更高效的筛选来源。

本实验首先从肝癌患者腹水 TIL 中纯化获得含有 TCM成分的 CD8+CD62L+T 细胞。选择 CD62L 为纯化标志的理由是：①CD62L 是初始 T 细胞和 TCM的共同标记。经 CD62L 纯化可排除已经抗原刺激活化，但抗原特异性未知的活化 T 细胞和效应型记忆性 T 细胞（effector memory T cell，TEM）[7]。②由于 TIL 细胞数量有限，并预先经过了 CD8 磁珠分选。纯化步骤过多将极大增加细胞损失数量，影响最终获得抗原特异性 T 细胞的数量。在纯化获得 CD8+CD62L+T 细胞后，我们鉴定了其中的 TCM比例。随后以肝癌相关抗原 AFP 九肽刺激 CD8+CD62L+T 细胞。以 CD137+T 细胞比例明确了抗原特异性 T 细胞活化程度后，最终通过磁珠纯化获得了针对 AFP 抗原肽的特异性 T 细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 HLA-A2+AFP+肝癌患者腹水样本由东莞市人民医院肿瘤内科收集，患者签署知情同意书。抽取HLA-A2+健康志愿者外周血样本。

1.1.2 细胞株 人 TAP 缺陷 T2 细胞株为本实验室保存。

1.1.3 主要试剂 RPMI 1640 培养基、胎牛血清为美国 Gibco 公司产品；人淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品；重组人 IL-2、IL-15 为美国 R & D 公司产品；HLA-A2 限制性 AFP218-226表位 9 肽（LLNQHACAV）由杭州中肽生化有限公司合成；PC5 标记抗人 CD8 抗体、FITC 标记抗人 CD62L 抗体、PE 标记抗人 CD44 抗体、ECD 标记抗人 CD45RO 抗体、PE 标记抗人 CD137 抗体均购自美国 BioLegend 公司；CD8 阴选磁珠试剂盒、CD62L 阳选磁珠试剂盒、CD137 阳选磁珠试剂盒均购自德国 Miltenyi 公司。

1.2 方法

1.2.1 腹水 TIL 分离 取新鲜抽取的 HLA-A2+AFP+肝癌患者腹水样本，与无菌生理盐水按 1:1 的比例稀释并混匀，加入淋巴细胞分离液，Ficoll-Hapaque 密度梯度离心法分离单个核细胞。

1.2.2 人 PBMC 分离 抽取 HLA-A2+健康人静脉血，Ficoll-Hapaque 密度梯度离心法分离 PBMC。

1.2.3 CD8+T 细胞纯化 腹水 TIL 及健康人 PBMC 分离当天，以免疫磁珠法完成 CD8+T 细胞纯化。根据试剂盒说明书完成操作。本步磁珠分离为阴选（杂细胞结合磁珠被吸附于分选柱，收集未结合磁珠而流出的 CD8+T 细胞）。

1.2.4 CD8+CD62L+T 细胞纯化 以免疫磁珠法从 CD8+T 细胞中进一步纯化 CD62L+T 细胞。根据试剂盒说明书完成操作。本步磁珠分离为阳选（杂细胞流出，洗脱并收集结合磁珠后被吸附于分选柱上的 CD62L+T 细胞）。最终获得 CD8+CD62L+T 细胞。在添加 10% 胎牛血清、双抗（青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml）的 RPMI 1640 完全培养液中培养。分离后第 1 天，加入重组人 IL-2（50 IU/ ml）和重组人 IL-15（1 ng/ml）。每隔 3 天换液。

1.2.5 流式细胞术检测 T 细胞表面标志分子表达 PC5 标记 CD8 抗体、FITC 标记 CD62L 抗体、PE 标记 CD44 抗体、ECD 标记 CD45RO 抗体染色后上机。检测 CD8+CD62L+T 细胞中以上 4 种分子表达阳性的细胞比例。

1.2.6 肿瘤相关抗原肽刺激 T 细胞 T2 细胞负载 HLA-A2 限制性 AFP218-226表位 9 肽（1 μmol/L）刺激活化分别来源于肝癌患者 TIL 和健康人 PBMC 的 CD8+CD62L+T 细胞（数量为 5 × 106~ 1 × 107个，与 T2 细胞数量比例为 5:1）。在 T 细胞分离后于第 3 和第6 天进行两轮刺激。

1.2.7 CD137+T 细胞检测与纯化 第 2 轮抗原肽刺激 24 h 后。PE 标记 CD137 抗体染色，流式细胞术检测分别来源于肝癌患者 TIL 和健康人 PBMC 的 CD8+CD62L+T 细胞经抗原刺激后 CD137+T 细胞比例，并以免疫磁珠法完成 CD137+T 细胞纯化。

2 结果

2.1 CD8+CD62L+T 细胞纯化

以 CD8 阴选磁珠从来自肝癌患者腹水 TIL 和健康人外周血 PBMC 中（各完成 3 个样本）纯化 CD8+T 细胞，纯度均高于 95%。本步选择阴选磁珠的目的是避免 CD8+T细胞与抗体包被磁珠结合，影响下一步 CD62L+T 细胞纯化。获得 CD8+T 细胞后，于当日内完成第二步 CD62L+阳选磁珠纯化，获得分别来自肝癌患者腹水 TIL 和健康人外周血 PBMC 的 CD8+CD62L+T 细胞，纯度> 95%（图 1）。

2.2 CD8+CD62L+T 细胞中 TCM亚群比例

通过 CD62L 磁珠纯化，排除了 CD8+T 细胞中 CD62L 阴性表达的活化 T 细胞和 TEM。以 CD45RO 和 CD44 为表面标记，实验进一步检测了 CD8+CD62L+T 细胞中 TCM（表型为 CD45RO+CD44high）及初始 T 细胞（CD45RO-CD44-）比例。如图 2 结果所示，来源于肝癌患者腹水的 TIL 和健康人 PBMC 的CD8+CD62L+T 细胞都存在一定比例的 TCM。其中 TIL 来源 CD8+CD62L+T 细胞中的 TCM比例较高，但尚需要完成更多样本的检测以得出明确结论。

2.3 肿瘤相关抗原肽刺激后CD137+T细胞比例

以 TAP 缺陷性 T2 细胞株（仅递呈外源性抗原肽）负载 AFP218-226表位 9 肽，刺激来源于肝癌患者腹水 TIL 和健康人 PBMC 的 CD8+CD62L+T 细胞（各完成 3 例）。如图 3 结果所示，抗原肽刺激后，腹水 TIL 来源 CD8+CD62L+T 细胞有较高的 CD137+T 细胞比例（介于 7% ~ 25%）（图 3A ~ C）。与之相比，健康人 PBMC 来源 CD8+CD62L+T 细胞经抗原刺激后 CD137+T 细胞比例较低（小于 4%）（图 3D ~ F）。

2.4 CD137+T 细胞纯化

以 CD137 磁珠对上述各 3 例经 AFP 抗原刺激的肝癌患者腹水 TIL 和健康人 PBMC 来源 CD8+CD62L+T 细胞完成纯化。从其中两例肝癌患者腹水 TIL 来源CD8+CD62L+T 细胞中纯化获得了 CD137+T 细胞，纯度大于 95%（图 4）。数量级约在 105。而健康人 PBMC 来源 CD8+CD62L+T 细胞由于比例较低，几乎难以通过磁珠纯化获得 CD137+T 细胞。

A：TIL 中 CD8+T 细胞比例；B：磁珠纯化后 CD8+T 细胞比例；C：CD8+T 细胞中 CD62L+ 细胞比例；D：磁珠纯化后 CD62L+T 细胞比例

A ~ C：肝癌患者TIL 样本1 ~ 3；D ~ F：健康人 PBMC 样本 1 ~ 3

A ~ C：肝癌患者TIL 样本 1 ~ 3；D ~ F：健康人 PBMC 样本 1 ~ 3

A：肝癌患者 TIL 样本 1；B：肝癌患者 TIL 样本 2

3 讨论

分离获得可以高亲和力与肿瘤抗原结合的特异性 CD8+T 细胞是提高肿瘤免疫治疗效果的重要基础[1]。然而由于外周血中的成熟 T 细胞在发育过程中经历了胸腺的阴性选择，使能够和肿瘤抗原（由于肿瘤免疫编辑，其成分接近正常组织细胞表达的分化抗原）高亲和力结合的 T 细胞被清除[8]。因此从肿瘤患者体内获得足够数量的抗原特异性 T 细胞难度较大。

研究者早就发现，与缺乏肿瘤抗原识别功能的外周血T 细胞不同，肿瘤局部浸润的 TIL 提示了宿主对肿瘤的免疫反应[9]。特别是 TIL 中的 CD8+T 细胞可能与肿瘤良好预后直接相关[10]。而关于肿瘤局部浸润记忆性 T 细胞的研究更是为解决肿瘤抗原特异性T 细胞来源的问题提供了一条可能的思路。由于肿瘤局部浸润高水平的 CD45RO+记忆性 T 细胞提示了更少的早期恶性侵袭标志，更慢的病理进展进程和更长的生存期[5]。提示肿瘤患者体内部分记忆性 T 细胞可在局部提供较长期的抗肿瘤免疫保护。通过选择免疫功能相对较为确定的肿瘤浸润记忆性 T 细胞作为筛选来源，可望有效提高肿瘤抗原特异性 T 细胞的筛选效率。

本实验收集 HLA-A2 阳性 AFP 抗原表达阳性的肝癌患者腹水，从中分离出 TIL。随后进行 CD8+及 CD62L+两步磁珠纯化，获得 CD8+CD62L+T 细胞。完成磁珠纯化后，以 CD45RO 和 CD44 为标志分子[11]，实验进一步检测了 CD8+CD62L+T 细胞中初始 T 细胞和 TCM的亚群比例。结果证实，来源于肿瘤患者 TIL 的 CD8+CD62L+T 细胞存在着一定比例的 CD45RO+CD44highTCM。

实验随后以肿瘤相关抗原 AFP 抗原肽刺激了肝癌患者TIL 来源及健康人 PBMC 来源的CD8+CD62L+T细胞。以上抗原 9 肽已被证实可在体外有效刺激 T 细胞活化并产生 CTL 效应（HLA-A2 限制性）[12]。结果显示，肝癌患者TIL 来源CD8+CD62L+T 细胞经抗原刺激后，可以观察到较为明显的CD8+CD137+细胞亚群。而健康人PBMC 来源 CD8+CD62L+T 细胞经抗原刺激后 CD137+细胞比例较低。由于肿瘤患者初始 T 细胞难以有效识别肿瘤抗原，最终接触肿瘤抗原肽刺激被有效活化的抗原特异性 T细胞可能主要来源于 CD8+CD62L+T 细胞中的 CD45RO+CD44highTCM。

以上结果提示，与正常人 PBMC 相比，肿瘤患者 TIL来源 CD8+CD62L+细胞中存在着可识别肿瘤抗原的 TCM，并在肿瘤抗原刺激后活化产生抗原特异性 T 细胞，从而在肿瘤局部提供有效的免疫保护。在肿瘤相关抗原肽刺激并明确 CD137+T 细胞活化比例后，实验最终通过磁珠分选，从两例肝癌患者 TIL 中纯化获得了一定数量可识别 AFP 抗原肽的 CD137+抗原特异性 T 细胞。通过本实验所建立的方法，为进一步大量扩增抗原特异性 T 细胞，并通过分子生物学方法从抗原特异性 T 细胞中鉴定肿瘤抗原特异性 TCR 基因奠定了必要的实验基础。

[1] Wolfl M, Kuball J, Ho WY, et al. Activation-induced expression of CD137 permits detection, isolation and expansion of the full repertoire of CD8+ T cells responding to antigen without requiring knowledge of epitope specificities. Blood, 2007, 110(1):201-210.

[2] Watts TH. TNF/TNFR family members in costimulation of T cell responses. Annu Rev Immunol, 2005, 23:23-68.

[3] Dawicki W, Watts TH. Expression and function of 4-1BB during CD4 versus CD8 T cell responsesin vivo. Eur J Immunol, 2004, 34(3):743- 751.

[4] Buhrman JD, Slansky JE. Improving T cell responses to modified peptides in tumor vaccines. Immunol Res, 2013, 55(1-3):34-47.

[5] Pagès F, Berger A, Camus M, et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med, 2005, 353(25):2654-2666.

[6] Berger C, Jensen MC, Lansdorp PM, et al. Adoptivetransfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. J Clin Invest, 2008, 118(1):294- 305.

[7] Boyman O, Létourneau S, Krieg C, et al. Homeostatic proliferation and survival of naïve and memory T cells. Eur J Immunol, 2009, 39(8):2088-2094.

[8] Rabinovich GA, Gabrilovich D, Sotomayor EM. Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells. Annu Rev Immunol, 2007, 25:267-296.

[9] Naito Y, Saito K, Shiiba K, et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Res, 1998, 58(16):3491-3494.

[10] Sato E, Olson SH, Ahn J, et al. Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(51):18538-18543.

[11] Wu F, Zhang W, Shao H, et al. Human effector T cells derived from central memory cells rather than CD8(+)T cells modified by tumor-specific TCR gene transfer possess superior traits for adoptive immunotherapy. Cancer Lett, 2013, 339(2):195-207.

[12] Liu Y, Daley S, Evdokimova VN, et al. Hierarchy of alpha fetoprotein (AFP)-specific T cell responses in subjects with AFP-positive hepatocellular cancer. J Immunol, 2006, 177(1):712-721.

国家自然科学基金（31100664）；广东省自然科学基金（10151022401000024）；东莞市科技计划项目（2011105102027）

黄树林，Email：shulhuang@sina.com

2014-05-22

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.012