内质网应激对3T3-L1脂肪细胞成纤维细胞生长因子21 mRNA表达的调节作用

万晓珊，刘彦隆，张翼，肖业臣，张海淼，许竹梅，肖健



内质网应激对3T3-L1脂肪细胞成纤维细胞生长因子21 mRNA表达的调节作用

万晓珊，刘彦隆，张翼，肖业臣，张海淼，许竹梅，肖健

325035 温州医科大学药学院（万晓珊、刘彦隆、张翼、肖业臣、许竹梅、肖健）；430075 武汉华大医学检验所有限公司（张海淼）

在 mRNA 水平探讨内质网应激对 3T3-L1 脂肪细胞成纤维细胞生长因子 21 表达的影响。

利用经典鸡尾酒法诱导 3T3-L1 前脂肪细胞分化，再用毒胡萝卜内酯分别按照剂量梯度（0、6.25、12.5、25、50 和 100 nmol/L）和时间梯度（0、1、3、6 和 12 h）进行处理，实时 PCR 检测内质网应激相关蛋白C/EBP 同源蛋白和葡萄糖调节蛋白 78 以及成纤维细胞生长因子 21 mRNA 的表达水平。

毒胡萝卜内酯能诱导分化成熟的 3T3-L1 脂肪细胞发生内质网应激，促进 C/EBP 同源蛋白、葡萄糖调节蛋白 78 和成纤维细胞生长因子 21 mRNA 水平显著升高，且与毒胡萝卜内酯的剂量和处理时间呈正相关。当用 100 nmol/L毒胡萝卜内酯处理 6 h 后，成纤维细胞生长因子 21 mRNA 水平显著增高，为对照组的 114.55 倍（< 0.05）。蛋白激酶C 抑制剂钙磷酸蛋白 C 能阻断由毒胡萝卜内酯诱导的内质网应激，并伴随成纤维细胞生长因子 21 mRNA 水平的下降。

内质网应激能上调 3T3-L1 脂肪细胞成纤维细胞生长因子 21 mRNA 表达，且可被蛋白激酶C 抑制剂钙磷酸蛋白C 阻断。

内质网应激； 3T3-L1 细胞； 成纤维细胞生长因子 21

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）家族共有 22 个成员，分为 7 个亚家族，其主要功能涉及胚胎发育、细胞增殖、组织修复和肿瘤发生等[1-3]。2000年，Nishimura 等[4]首次从小鼠胚胎中分离得到 FGF21。研究发现，FGF21 是 FGF 家族中的一个非典型性成员，其主要生物学功能是调节糖脂代谢[5-8]。

目前认为，FGF21 主要在肝脏中表达，白色脂肪组织、胸腺、骨骼肌及胰岛 β 细胞中也有少量表达[5,9-10]。临床报告显示，非酒精性脂肪肝、2 型糖尿病和肥胖等代谢疾病患者的血清 FGF21 水平显著高于正常人群[11-13]。许多动物实验也得到了类似的结果，与野生型小鼠相比，高脂饮食诱导的肥胖小鼠和遗传型肥胖小鼠的血清 FGF21 水平明显升高，且在肝脏和白色脂肪组织中，FGF21 mRNA 水平呈高表达[7, 14-16]。这些研究结果表明在糖尿病和肥胖等病理状态下，FGF21 浓度“应激性”升高，提示这可能是一种反馈性调节，但具体调控机制尚未阐明。

内质网是真核细胞中一种重要的细胞器，是蛋白质合成、修饰的场所，参与糖类和脂类代谢，并维持细胞内钙平衡。但当细胞受到缺氧、毒性药物、感染等刺激时，内质网内未折叠蛋白聚集，钙离子平衡失调，引起内质网应激，这是机体的一种代偿性过程，对细胞有保护作用。大量研究报道，内质网应激与肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病等代谢疾病密切相关。现已证实，肥胖可以引起肝脏和脂肪组织发生内质网应激[17-18]，同时内质网应激也是触发胰岛素抵抗和 2 型糖尿病的核心机制[19-21]。

然而，肥胖和糖尿病等代谢性疾病中 FGF21 的变化是否与内质网应激有关尚未见报道。本研究用毒胡萝卜内酯（thapsigargin，TG）对已分化的脂肪细胞进行干预，建立内质网应激细胞模型，通过实时 PCR 检测内质网应激信号分子葡萄糖调节蛋白 78（glucose regulated protein 78，GRP78）和 C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）及 FGF21 的表达水平，为探讨代谢性疾病中 FGF21 的调控机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠前脂肪细胞株 3T3-L1 购于美国菌种保藏中心（ATCC）；高糖 DMEM 培养基、RPMI 1640 培养基、胎牛血清（FBS）、实时 PCR 试剂盒购于美国 Invitrogen 公司；重组人胰岛素、地塞米松（dexamethasone，Dex）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（isobutyl methylxanthine，IBMX）和毒胡萝卜内酯购于美国 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠 3T3-L1 脂肪细胞的培养和分化 用含 10% FBS 的高糖 DMEM 培养基培养和维持 3T3-L1 前脂肪细胞，用经典鸡尾酒法诱导其分化。当细胞长至接触抑制 2 d 后，用分化液I（含 10 mg/L 胰岛素、0.25 μmol/L Dex、0.5 mmol/L IBMX、10% FBS 的高糖 DMEM 培养基）培养2 d，再用分化液II（含 10 mg/L 胰岛素、10% FBS 的高糖 DMEM 培养基）培养 2 d，之后用含 10% FBS 的高糖 DMEM 培养基继续培养，每 2 天换液一次，分化8 ~ 9 d 后，分化率约为 90%，可用于下一步实验。对分化成熟的 3T3-L1 细胞更换新鲜的完全培养基，然后用不同剂量 TG（0、6.25、12.5、25、50 和 100 nmol/L）处理 6 h 和用 100 nmol/L TG 处理不同时间（0、1、3、6 和12 h），以 DMSO 处理组作为对照，分别收集细胞，每组至少重复 3 次。

用 250 nmol/L 蛋白激酶C 抑制剂钙磷酸蛋白C 预处理已分化的 3T3-L1 脂肪细胞 2 h，然后用 100 nmol/L TG 处理 6 h，以未处理组作为对照，收集细胞，至少重复 3 次。

1.2.2 实时 PCR 检测 CHOP、GRP78 及 FGF21 的 mRNA 水平 用 Trizol 法提取总 RNA，260/280比值为 1.8 ~ 2.0，经逆转录反应合成 cDNA。然后利用 SYBR 荧光实时 PCR 法检测 CHOP、GRP78 和 FGF21 mRNA 相对表达量。实验所用引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以 β-actin 为内参照基因，β-actin 引物序列：上游5' TGGAATCCTGTGGCATCCATGAA AC 3'；下游5' TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTC CG 3'。CHOP 引物序列：上游5' GCATGAAGGAG AAGGAGCAG 3'；下游5' CTTCCGGAGAGACAG ACAGG 3'。GRP78 引物序列：上游5' CAGATCTTCTCCACGGCTTC 3'；下游5' GCAGGAGGAATTC CAGTCAG 3'。FGF21 引物序列：上游5' CTGGGG GTCTACCAAGCATA 3'；下游5' CACCCAGGATT TGAATGACC 3'。反应体系为 10 μl，包含 Power SYBR Green PCR Master Mix 5 μl，上游引物 0.2 μl，下游引物 0.2 μl，cDNA 模板 0.5 μl，ddH2O 4.1 μl。反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 45 s，40 个循环。每个样本设 3 个复孔，同时设无模板阴性对照。

1.3 统计学处理

反应结束后，各个样本的 Ct 值分别取平均数。以对照组的靶基因表达量为1，2-△△Ct即为实验组相对对照组靶基因表达的倍数。

2 结果

2.1 不同浓度 TG 对 3T3-L1 脂肪细胞 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表达的影响

分别用不同浓度 TG 处理 3T3-L1 脂肪细胞 6 h，以 DMSO 作为空白对照，用实时 PCR 检测 FGF21、CHOP 和 GRP78 的 mRNA 表达水平。结果显示，FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平随着剂量的升高呈递增趋势（图 1），当 TG 浓度为 100 nmol/L 时，FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA达到最高，具有显著性差异（< 0.05）。

2.2 TG 处理不同时间对 3T3-L1 脂肪细胞 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表达的影响

100 nmol/L TG 处理 3T3-L1 脂肪细胞 1、3、6 和 12 h 后，收集细胞，实时 PCR 检测 FGF21、CHOP 和 GRP78 的 mRNA 表达水平。如图 2 所示，随着处理时间的延长，FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表达水平上升，6 h 时达到峰值，12 h 后逐渐降低。处理 6 h，FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平分别为对照组的 114.55、23.20和 12.33 倍，具有显著性差异（< 0.05）。因此，在后面的实验中我们选择 100 nmol/L TG 处理 6 h 作为最佳处理条件。

2.3 蛋白激酶C 抑制剂钙磷酸蛋白 C 对 TG 诱导的内质网应激的影响

250 nmol/L钙磷酸蛋白 C 预处理 3T3-L1 脂肪细胞 2 h，然后再加入100 nmol/L TG 处理 6 h，收集细胞，实时 PCR 检测 FGF21、CHOP 和GRP78 mRNA 的表达水平。如图 3 所示，与对照组相比，TG 单独处理组中，FGF21、CHOP 和GRP78 mRNA 水平显著升高（< 0.05），这与前期实验结果一致；与 TG 单独处理组相比，钙磷酸蛋白 C 预处理组中 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平显著降低（< 0.05）。

FGF21 mRNA 相对水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相对水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 0 0.25 12.5 25 50 100 0 0.25 12.5 25 50 100 TG 浓度（nmol/L）TG concentration (nmol/L)A TG 浓度（nmol/L）TG concentration (nmol/L)B

Figure 1 Effect of different doses of TG on mRNA levels of FGF21 (A), CHOP (B) and GRP78 (C) in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

FGF21 mRNA 相对水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相对水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 0 1 3 6 12 0 1 3 6 12 时间（h）Time (h)A 时间（h）Time (h)B

Figure 2 Effect of TG on mRNA levels of FGF21 (A), CHOP (B) and GRP78 (C) after treatment for different time in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

FGF21 mRNA 相对水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相对水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 对照组 TG 钙磷酸蛋白 C + TG Control Calphostin C + TGA 对照组 TG 钙磷酸蛋白 C + TG Control Calphostin C + TGB

Figure 3 Effect of PKC inhibitor on TG-induced mRNA levels in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

3 讨论

FGF21 是一个与糖脂代谢有关的因子，临床研究和动物实验结果均显示，肥胖和糖尿病等病理状态下，FGF21 水平显著升高，且与甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、胰岛素等指标呈正相关，FGF21 的升高被认为是一种反馈性上调，但具体的分子机制未见报道。

文献报道，肥胖中脂质过量堆积、胞内能量流动和养分利用障碍会诱发内质网应激[17, 22]，内质网应激激活的 IRE1α-JNK 信号通路会导致胰岛素受体及其底物功能障碍，这是发生胰岛素抵抗的重要原因[17, 23]。持续的胰岛素抵抗会促使胰岛素不断合成和分泌，进而引起胰岛 β 细胞的内质网发生代偿性扩张，蛋白质合成增加，导致未成熟的蛋白质在内质网中积累，进一步加重内质网应激，最终使 β 细胞衰竭，引发 2 型糖尿病。由此可见，肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病中均存在不同程度的内质网应激，表明内质网应激与这些代谢疾病的发生发展密切相关。

TG 是内质网膜 Ca2+-ATP 酶抑制剂，诱导胞浆内 Ca2+浓度上升和内质网储存钙的下降，从而引起内质网应激。本实验应用 TG 处理体外分化培养的 3T3-L1 脂肪细胞，发现内质网应激的标志分子 GRP78 和 CHOP mRNA 水平随 TG 浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增高，表明成功构建了 3T3-L1 脂肪细胞内质网应激模型。同时，FGF21 的 mRNA 水平也随着内质网应激加剧而升高。当用 100 nmol/L TG 处理 6 h 后，FGF21 的 mRNA 水平为对照组的 114.55 倍，与对照组有显著性差异，但是 12 h 后，表达水平又有所下降，这可能是由于处理时间过长，TG 对细胞产生了一定的毒性。而与 TG 处理组相比，蛋白激酶C 抑制剂钙磷酸蛋白 C 预处理阻断了内质网应激，CHOP 和 GRP78 的 mRNA 水平显著降低，同时伴随 FGF21 mRNA 水平的降低。表明在分化的 3T3-L1脂肪细胞中，内质网应激上调了 FGF21 表达，提示在肥胖和糖尿病等代谢性疾病中 FGF21 水平的升高可能是由内质网应激引起的。同时，TG 是一种典型的 Ca2+释放剂，而胞内高浓度 Ca2+会活化蛋白激酶C，我们推测 FGF21 的调控可能与 Ca2+介导的信号通路密切相关，具体机制有待进一步研究。

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Effect of endoplasmic reticulum stress on FGF21 mRNA expression in the differentiated 3T3-L1 cells

WAN Xiao-shan, LIU Yan-long, ZHANG Yi, XIAO Ye-chen, ZHANG Hai-miao, XU Zhu-mei, XIAO Jian

To study the effect of endoplasmic reticulum stress on FGF21 expression in the differentiated 3T3-L1 cells.

3T3-L1 pre-adipocytes were culturedand differentiated into adipocytes, and then treated with different concentrations of thapsigargin (TG) (0, 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 nmol/L) for 6 h or 100 nmol/L TG for different time (0, 1, 3, 6 and 12 h). The mRNA levels of CHOP, GRP78 and FGF21 were detected using real time PCR.

TG-induced endoplasmic reticulum stress increased mRNA expression of CHOP,GRP78 and FGF21 in a dose- and time- dependent manner. FGF21 mRNA expression in 3T3-L1 adipocytes treated by 100 nmol/L TG for 6 h was significantly higher than that of control group (< 0.05). PKC inhibitor calphostin C markedly inhibited TG-induceed endoplasmic reticulum stress, and reduced FGF21 mRNA expression.

FGF21 mRNA expression can be up-regulated by endoplasmic reticulum stress, which can be inhibited by PKC inhibitor calphostin C.

Endoplasmic reticulum stress; 3T3-L1 cells; Fibroblast growth factor 21

XU Zhu-mei, Email: profxzm2008@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.004

国家自然科学基金（81170813、81300311）；浙江省自然科学基金（Y2100048、LY12H03001、LQ13H280002）；浙江省重点科技创新团队项目（2010R50042）

许竹梅，Email：profxzm2008@126.com

2014-03-26

Author Affiliations: School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China (WAN Xiao-shan, LIU Yan-long, ZHANG Yi, XIAO Ye-chen, XU Zhu-mei, XIAO Jian); BGI Wuhan, Wuhan 430075, China (ZHANG Hai-miao)