Cdc42在种植体纳米化影响成骨细胞功能中的作用

赵震锦， 冯翠娟， 田玉楼， 陈钰文， 张 扬

实验研究

Cdc42在种植体纳米化影响成骨细胞功能中的作用

赵震锦， 冯翠娟， 田玉楼， 陈钰文， 张 扬

目的研究Cdc42在纳米化种植体促进成骨细胞功能中的作用。方法将纳米化种植体与成骨细胞联合培养，通过Western Blot检测Cdc42活性蛋白含量，以及荧光染色检测成骨细胞内F-actin分布，扫描电镜观察成骨细胞形态，MTT检测成骨细胞增殖。结果纳米化种植体使成骨细胞内Cdc42活性蛋白含量明显增多，Toxin B抑制后其活性明显下降，纳米化种植体表面成骨细胞形态不规则，细胞骨架明显，伸出较多伪足，采用Toxin B处理后细胞形态变圆，伪足减少。成骨细胞增殖功能随种植体纳米化而明显增高，在Toxin B处理后下降。结论种植体粗化使Cdc42表达增加，可能通过Cdc42调节成骨细胞的黏附及增殖。

纳米化种植体； Cdc42； 成骨细胞

为提高种植体支抗的稳定性，改变钛表面的物理形态或化学组成，将生物惰性钛金属改造成生物活性材料是长期以来学者们一直追寻的目标。为此，研究者采用了多种钛种植体表面处理技术，来提高种植体与骨结合的速度和强度，如表面喷砂技术、羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)及磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)表面涂层技术、阳极氧化技术和喷砂加酸蚀表面处理技术等[1-3]。学者们[4-5]对种植体钛片进行表面纳米化处理增加其生物学活性，促进了成骨细胞的黏附、增殖及种植体的稳定性，认为纳米化材料所形成的纳米级孔隙更加有利于成骨细胞丝足及伪足的附着，但对于其内在信号通路机制未进行深入探讨。研究结果显示,种植体表面粗化对成骨细胞的细胞骨架有影响[5-6]，而Cdc42在多种细胞中通过细胞骨架调节细胞的黏附[7-8]，为此笔者对Cdc42/细胞骨架在种植体纳米化调节成骨细胞功能的机制中的作用进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂 实验材料：人成骨肉瘤细胞系MG63，购自北京基础医学细胞中心，种植体材料由东北大学材料电磁过程研究教育部重点实验室佟伟平惠赠并进行表面粗化。实验前均常规超声清洗、烘干、湿热法消毒。实验试剂：MEM培养基(美国GIBCO公司)，MTT试剂(美国AMRESCO公司)，Triton-100(0.2%)和TRITC-labeled phalloidin(美国SIGMA公司)。

1.2 实验分组 共分3组。对照组(C组)：成骨细胞与光滑种植体钛片联合培养；纳米化组(N组)：成骨细胞与纳米化的种植体钛片联合培养；Toxin B组(T组)：成骨细胞采用Toxin B处理3 h后再与表面纳米化的种植体钛片联合培养。

1.3 观察Cdc42活性蛋白表达 联合培养4 h后，收集成骨细胞，用1%NP- 40缓冲液裂解细胞，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，收集上清液中加入结合GST-p21-PAK融合蛋白的谷胱甘肽Sepharose 4B琼脂糖珠，旋转混合仪上4 ℃过夜用于沉淀活化的Cdc42，加热变性，10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、抗体结合及化学发光显色，使用兔抗Cdc42多克隆抗体(P1)进行Western Blot，检测各组种植体表面成骨细胞内Cdc42活性蛋白的表达，采用Chemi-genius凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。

1.4 观察Cdc42对F- actin的影响 联合培养4 h后甲醛固定，Triton X-100室温透膜，TRITC标记的鬼笔环肽37°染色30 min，荧光显微镜观察肌动蛋白分布。

1.5 观察Cdc42对成骨细胞在种植体表面的形态及增殖黏附的影响 联合培养4 h后5%戊二醛固定，扫描电镜观察成骨细胞的形态改变； 在1、4、7 d分别弃培养液，每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml) 4 h，吸净MTT，加入150 μl DMSO，轻轻震荡10 min，使用酶标仪490 nm波长下测吸光度值(A)。重复实验3次。

2 结果

2.1 纳米化种植体对成骨细胞内Cdc42活性蛋白含量的影响 在纳米化种植体表面的成骨细胞内Cdc42活化水平明显增高，而Toxin B预处理部分抑制Cdc42活化(图1)。

2.2 Cdc42对纳米化种植体表面成骨细胞形态及肌动蛋白浓聚的影响 纳米化种植体表面成骨细胞伸展，伪足形成，肌动蛋白聚合，Toxin B预处理后肌动蛋白聚合减少，细胞形态变圆，伪足减少，显示Cdc42可能参与这个过程(图2)。

2.3 Cdc42对成骨细胞在种植体表面增殖的影响 在复合培养5 d后，纳米化种植体表面细胞黏附增殖水平明显高于对照组，Toxin B处理后细胞黏附增殖水平降低。这说明，移植料表面成骨细胞黏附增值水平随培养时间延长而增高。见表1。

3 讨论

错牙合畸形治疗过程中支抗的控制非常重要，纳米种植体的出现为正畸临床提供了“绝对”支抗，扩大了正畸矫治的适应证[1，9-10],因此，学者们对纳米种植体进行了大量研究。目前,学者们采取了多种方法如钛浆喷涂、酸蚀、喷砂、阳极氧化等来进行种植体的表面处理[2-5，11-13]。有学者[4-5]进行各种表面处理的目标，是种植体表面的纳米化，从而增加其生物学活性，促进成骨细胞的黏附、增殖及种植体的稳定性。学者们[3，5]认为，纳米化材料所形成的纳米级孔隙更加有利于成骨细胞丝足及伪足的附着，但对于其内在信号通路机制没有进行深入探讨。本研究采用纳米化纯钛种植体材料进行的前期研究工作[5]已经证明，种植体纳米化对成骨细胞功能及黏附的影响，细胞骨架有所改变，但影响成骨细胞迁移细胞骨架改变的分子机制尚不清楚。

图1 免疫沉淀Western Blot检测Cdc42活性蛋白水平图2 扫描电镜观察成骨细胞形态(SEM ×2000) a. C组 b. N组 c. T组

Fig1 Level of Cdc42 detected by Western Blot.Fig2 Morphology of osteoblast (SEM ×2000). a. Group C. b. Group N. c. Group T.

表1 各组成骨细胞黏附增殖测定结果

注：*与C组组间差异具有统计学意义，P<0.05；#与N组组间差异具有统计学意义，P<0.05

Rho GTPase家族成员中的Racl和Cdc42对肌动蛋白细胞骨架都有其特异的生物效应，我们先期的研究成果表明[7]，受到外界刺激后，细胞骨架改变定向迁移主要涉及PI3K活化，通过Rac/cdc42导致肌动蛋白聚合，使细胞发生定向迁移及黏附。因此，我们检测了Cdc42在纳米化种植体促进成骨细胞黏附及调节功能过程中的作用。本研究中，我们证实Cdc42是参与纳米化种植体调节成骨细胞功能及黏附的信号分子。结果显示，纳米化种植体表面活性Cdc42蛋白水平增高。Rho GTPases通过活性(GTP结合)及非活性(GDP结合)形式之间的转换，控制细胞生理过程，扮演“分子开关”的角色[7-8]。活性Cdc42含量的增高，支持了Cdc42在纳米化种植体调节成骨细胞功能机制参与的可能性。

细胞骨架的形态反应了细胞与种植体表面结合的能力，在种植体经过表面处理且增加生物学活性后，其表面细胞通常伸展，形态不规则，伪足增加[13-15]。我们的结果显示也如此，但将成骨细胞采用Cdc42拮抗剂Toxin B处理后，细胞在纳米化种植体表面黏附能力减弱，细胞形态近似圆形，伪足减少，说明Cdc42可能影响成骨细胞向种植体表面的迁移及黏附，Cdc42/Actin信号转导通路在种植体表面成骨细胞吸附和迁移的过程中扮演重要角色。同样，成骨细胞采用Cdc42拮抗剂Toxin B处理后，成骨细胞在纳米化种植体表面的增殖能力明显降低，显示Cdc42参与纳米化种植体调节成骨细胞增殖功能的机制[15]。

目前，对纳米种植体的临床应用研究较多，对其骨结合的内在机制研究较少。通过进行相关研究，以了解Cdc42/Actin信号转导通路对成骨细胞迁移、黏附的影响，有利于促使种植体骨整合，提高种植体的成功率，使之在正畸临床中能更加有效地发挥作用。

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RoleofCdc42infunctionofosteoblastonnano-phasetitaniumimplantmaterials

ZHAOZhen-jin,FENGCui-juan,TIANYu-lou,etal.

(DepartmentofOrthodontic,SchoolofStomatology,ChinaMedicalUniversity,LiaoningInstituteofDentalResearch,Shenyang110002,China)

ObjectiveTo investigate the role of Cdc42 in osteoblast function on nanophase-implant.MethodsThe osteoblast-like cell line MG63 was cultured on normal/nano-phase implants. The levels of activated Cdc42 were measured by the GTPase activity pull-down assay and western blot. Changes of actin cytoskeleton and morphological characteristics were observed by confocal laser scanning microscope (CLSM) and scanning electron microscope (SEM) respectively. Cell proliferation was detected by MTT.ResultsThe activation level of Cdc42 was increase when cultured on nano-phase implant and blocked by Toxin B treatment. The shape of osteoblast attached on implant was irregular with extended pseudopodium. After treated with Toxin B, the shape of cell tended to be round and pseudopodium decreased. The proliferation of osteoblast was increased when cultured on nano-phase implant but decreased after pretreatment by Toxin B.ConclusionNano-phase implant could increase the impression of active Cdc42. Nano-phase implant might improve the proliferation and inhesion of osteoblast through Cdc42.

Nano- phase implant; Cdc42; Osteoblast

辽宁省科学技术计划基金资助项目(200925010-29)

110002 辽宁 沈阳,中国医科大学口腔医学院 口腔正畸科

赵震锦(1975-)，女，辽宁黑山人，副教授，副主任医师，博士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.08.017

R329.2

A

1673-7040(2014)08-0496-03

2014-03-21)