A型肉毒毒素对兔植皮后皮片收缩相关因素的影响

刘 征， 范 飞， 王 欢， 徐奕昊， 田 乐, 尤建军， 王 盛， 李战强， 张 波

实验研究

A型肉毒毒素对兔植皮后皮片收缩相关因素的影响

刘 征， 范 飞， 王 欢， 徐奕昊， 田 乐, 尤建军， 王 盛， 李战强， 张 波

目的研究A 型肉毒毒素对兔植皮术后皮片收缩的相关因素影响。方法于兔背部沿脊柱两侧对称地制备两排共4个2 cm×2 cm正方形供皮区，切取全厚皮片，共形成20个创面。每只兔背部随机选取2个创面皮下注射A型肉毒毒素5 U，此为A组，共10个创面；其余未注射A型肉毒毒素的创面为B组。术后12 d，大体观察切口愈合及植皮成活情况。观察组织的HE染色标本中炎症细胞、成纤维细胞、胶原纤维的变化及免疫组织化学染色标本中α-SMA表达；测量每张图片α-SMA的积分光密度值。结果大体观察A组与B组切口愈合及皮片成活无明显差异。光镜下，观察A组较B组真皮中炎症细胞减少，胶原纤维相对细小、致密度下降，排列较规则，大体走向一致；成纤维细胞数量减少，较分散。A组与B组α-SMA的积分光密度值组间差异具有统计学意义(P=0.003)，A组α-SMA的表达较B组明显减少。结论A型肉毒毒素的注射不影响植皮的正常成活及切口愈合。可通过减少收缩过程中的成纤维细胞的数量、胶原的合成与沉积及炎症细胞的生成，以减少肌成纤维细胞中α-SMA的表达，达到抑制皮片收缩的目的。

植皮术； 皮片收缩； A 型肉毒毒素； 肌成纤维细胞； α-平滑肌肌动蛋白

A 型肉毒毒素是肉毒梭菌产生的一种外毒素, 主要作用于胆碱运动神经末梢，使肌肉麻痹,目前已被广泛用于治疗面部除皱、咬肌肥大、局部多汗症等。研究发现,A型肉毒毒素作用于肌成纤维细胞，对增生性瘢痕与瘢痕疙瘩有一定的预防与治疗作用[1]。大面积烧伤或创伤治疗的患者皮肤缺损通常涉及植皮,植皮后的皮片挛缩影响术后效果，限制其应用。自2013年6月至2014年2月，笔者对A型肉毒毒素注射兔植皮术后皮片的收缩部分相关因素的影响进行研究,并探讨其可能的作用机制。现报道如下。

1 材料来源

健康家兔5只，月龄6个月。体质量(2600±200) g。由中国医学科学院整形外科医院实验动物中心提供。家兔实验前1周单笼喂养。

2 实验方法

2.1 动物模型的制备 将家兔以速眠新肌肉注射麻醉(每100 g注射0.2 ml)，电动去毛机备背部皮肤，以预制好的模板于兔背部沿脊柱两侧用亚甲蓝各制备两排共4个2 cm×2 cm正方形供皮区，每个供区间隔4 cm的正常皮肤，切取全厚皮片，深至肉膜层，注意保持肉膜层完整，供皮区共形成20个创面。于每只兔背部随机选取2个创面，每个创面皮下注射A型肉毒毒素(美国ALLERGAN公司， 100 U/支)5 U，此为A组；未注射A型肉毒毒素的创面为B组。将每只兔1～5编号。将切取的皮片随机逐一植于供皮区的创面上，每个创面严格止血，3-0丝线间断缝合。术后常规单笼饲养，肌肉注射青霉素80万U，每天2次，持续3 d。定期观察植皮区的成活情况。12 d后，切除植皮区的全层皮肤及部分皮下组织，10%甲醛固定。组织块经石蜡包埋后,做常规切片，HE染色，免疫组化染色，光镜下观察组织学变化。

2.2 HE染色 4 μm切片,脱蜡,苏木精染液染色15 min,0.5%盐酸乙醇分化,流水冲洗后,0.5%伊红染液染色30 s,逐级乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片,光镜下观察组织病理学改变。

2.3 免疫组织化 4 μm切片,脱蜡,3%过氧化氢室温孵育封闭内源性过氧化酶,微波热修复3 min,用正常羊血清1∶9室温孵育30 min,以封闭非特异性抗原,加入小鼠抗兔α-SMA单克隆抗体(美国SIGMA公司, 工作浓度为1∶1200),37 ℃孵育90 min,复温后加辣根过氧化酶HRP标记的抗小鼠IgG(美国GBI公司),37 ℃静置20 min,DAB显色,苏木精复染,脱水封片,显微镜下观察，对免疫组织化学结果进行半定量分析。每个皮片均为4张切片，所有切片均在同一放大倍数(×200)、同一光强度下测量，每个切片5个视野，采用IPP 6.0图像分析软件分析肌成纤维细胞内α-SMA积分光密度值。

3 结果

3.1 大体观察 术后皮片生长良好，术后9 d，A组2、4号兔右下方植皮坏死，术后12 d，2、4号兔右下方皮片脱落,其余均生长良好，切口愈合良好，无感染、渗出、缺血或坏死，A型肉毒毒素注射未影响植皮的正常成活。

3.2 组织切片观察 光镜下观察A组真皮中有炎症细胞较少，胶原纤维相对细小、致密度下降，排列较规则，大体走向一致(图1a，b)。成纤维细胞数量较少；术后12 d组织切片HE染色B组与A组对比可见，光镜下观察B组真皮中有大量炎症细胞，含大量排列致密、粗大的胶原纤维，排列混乱(图1c，d)。成纤维细胞较多，胞体较大，胞核呈圆形或椭圆形，着色较深。表皮生长，真皮层厚度及皮肤附属器未见明显差别。

3.3 α-SMA免疫组织化学积分光密度值 术后12 d组织切片中可见α-SMA在肌成纤维细胞胞浆中可见棕黄色阳性染色(图2)，测量棕黄色颗粒的积分光密度值，通过积分光密度值反应组织中肌成纤维细胞α-SMA蛋白表达量。两组α-SMA的积分光密度值组间差异具有统计学意义(P=0.003)，A组α-SMA的表达较B组明显减少(表1)。

4 讨论

植皮收缩发生在两个阶段。当皮肤第1次取自其供区，其经历了即时的尺寸减小，简称作为早期收缩，早期收缩已发现9%～22%取决于皮片厚度，并且被认为是由真皮弹性纤维导致的。当皮片植入受区，进入晚期收缩。此收缩过程涉及一个复杂的细胞、细胞外基质和细胞因子之间的相互作用。成纤维细胞在皮片收缩过程中扮演着早期动力细胞，可促使皮片收缩。在皮肤创伤愈合过程中成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞同时具有成纤维细胞特性和平滑肌细胞固有的收缩特性[2]。肌成纤维细胞是一类具有明显收缩机能的成纤维细胞，有别于传统的成纤维细胞，其胞质内含有大量的微丝与散在的微管，与邻近细胞形成桥粒与缝隙连接，并与周围基质通过纤维连接蛋白形成连接，细胞的收缩反应可借这些结构传递到附近的细胞与基质中, 形成细胞-细胞之间和细胞-基质之间的联系，产生同步活动，大量肉芽组织收缩,成为收缩动力细胞的结构基础。研究发现，创面形成的早期并没有微丝的存在，所以肌成纤维细胞不是创面收缩的始动因素, 但参与了创面收缩过程,是创面收缩的直接动力, 众多肌成纤维细胞主动收缩并带动周围基质可导致创面收缩[3]。α-SMA为肌成纤维细胞的标记蛋白，α-SMA的表达与肌成纤维细胞的数量呈正相关，并区别于成纤维细胞。近年的研究表明, 在有收缩特性的病理组织中常见α-SMA 表达增加。大量实验证实，组织的收缩与α-SMA的表达呈正相关, 抑制α- SMA的的表达有可能降低收缩[4]。在创伤后新生肉芽组织开始生长时，即能观察到肌成纤维细胞, 随后细胞数量逐渐增多并达到最高峰, 然后肌成纤维细胞凋亡增加, 最后消失于稳定的瘢痕组织中。伤后7 d左右伤口周围的成纤维细胞增生,成纤维细胞逐渐转化肌成纤维细胞。随后，肌成纤维细胞继续迁移、爬行，与成纤维细胞共同参与创面收缩及肉芽组织的生长及塑形。伤后12 d, α-SMA表达高峰时, 肌成纤维细胞开始出现凋亡;伤后16 d, 当伤口闭合时, 发生凋亡的肌成纤维细胞数量明显增加, 在伤后20 d达高峰。大量成纤维细胞和肌成纤维细胞通过凋亡减少或消失。当伤口上皮化后，收缩停止，α-SMA消失[5]。肌成纤维细胞还可以通过一些潜在的机制促进创口的愈合，诸如呈递抗原，分泌对创口愈合必须的趋化因子、细胞因子和生长因子，分泌细胞外基质蛋白，促进血管发生、分化，参与创面收缩[6]。转化生长因子可以直接诱导培养的成纤维细胞转变为肌成纤维细胞，增加α-SMA 表达，上调成纤维细胞中胶原蛋白的表达，在体内和体外转化生长因子均是促使成纤维细胞变成肌成纤维细胞调节的最主要因素，增强肌成纤维细胞的迁移和收缩性能[7]。因此，转化生长因子作为组织修复和产生组织纤维化的关键因子。结缔组织生长因子作为成纤维细胞与平滑肌细胞分裂的趋化剂，也积极作用于转化生长因子合成和释放，不仅调节细胞的黏附和增长，也导致胶原的过度沉积。作为转化生长因子功能下游调节因子，结缔组织生长因子还可以独立调解瘢痕的增生和纤维化，作用于收缩过程，成纤维细胞的结缔组织生长因子增加导致增生性瘢痕[8]。转化生长因子刺激结缔组织生长因子表达，结缔组织生长因子反过来会影响胶原蛋白沉积，进而影响收缩过程。

图1 两组皮肤组织HE染色(×100) a.A组表皮层与真皮层 b.A组真皮层 c.B组表皮层与真皮层 d.B组真皮层图2 两组皮肤组织α-SMA蛋白免疫组化染色(×200) a.A组 b.B组

Fig1 Histological observation by HE (×100). a. epidermis and dermis of Group A. b. dermis of Group A. c. epidermis and dermis of Group B. d. dermis of Group B.Fig2 Histological observation by α-SMA immumohistochemical staining (×200). a. Group A. b. Group B.

表1 两组α-SMA积分光密度值

组别 a-SMA积分光密度值A35165153.72±17693211.72B47508163.92±19803028.64

A型肉毒毒素已经应用于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治疗，临床治疗效果较理想[1]。A型肉毒毒素可对成纤维细胞的生长周期造成影响，使成纤维细胞更多停滞在静止期，较少进入增殖期，有效地抑制了成纤维细胞的增长，且合成能力将明显下降，作用于收缩过程，在某种程度上起到抑制瘢痕的作用；对瘢痕组织中转化生长因子的生成也起到了抑制的关键作用[9]。还可能抑制瘢痕组织中结缔组织生长因子的生成[10]。A型肉毒毒素不影响创面愈合，可减少兔耳增生瘢痕中SP、转化生长因子和α-SMA的mRNA及蛋白的表达[11]。在挛缩性瘢痕的作用机制的探索性研究中发现，注射A型肉毒毒素后6个月,瘢痕表面皱缩,周围皮肤明显松弛,质软，可能与A型肉毒毒素能够抑制瘢痕内成纤维细胞中α-SMA及肌球蛋白-Ⅱ的表达有关[12]。基于以上研究，可以确定A型肉毒毒素可以影响收缩过程中的成纤维细胞、肌成纤维细胞的表达及多种细胞因子、细胞外基质的表达，但具体机制有待于实验的进一步研究。

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InfluenceofbotulinumtoxintypeAoncorrelationfactorsofskingraftcontractioninrabbit

LIUZheng,FANFei,WANGHuan,etal.

(the12thDepartmentofPlasticSurgery,PlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100144,China)

ObjectiveTo investigate the influences of botulinum toxin type A on expression of skin graft contraction.MethodsFour 2 cm×2 cm square donor sites from each rabbit were made on the bilateral back along the spine to make 20 wounds by cutting full thickness skin. Two wounds of each rabbit were chosen randomly to form the Group A (10), while the other two were the Group B (10). Wounds in the Group A were treated with 5 U botulinum toxin A and those in the Group B were treated without botulinum toxin A. The wound healing and survival of grafted skin were observed and inflammatory cells, fibroblasts and changes of collagen fiber were detected by HE and the expression of α-SMA was measured by IHC, the integrated optical density value of α-SMA was also detected.ResultsCompared with the Group B, the wounds healing and survival of grafted skin in Group A had no significant difference. Compared with the Group B, the inflammatory cells in the Group A was less, collagen fibers were relatively thinner and smaller with decreased density and regular alinement at the same direction and fibroblasts were less and scattered under light microscope. The integrated optical density value of α-SMA between the two groups had significant difference (P= 0.003). The expression of α-SMA in the Group A was weaker than that in the Group B.ConclusionThe effect of BTXA can reduce the number of fibroblasts, density of collagen fiber and expression of α-SMA in the contraction of process of grafted skin.

Skin grafting; Flap contraction; Botulinum toxin type A; Myofibroblasts; α-smooth muscle actin

100144 北京，中国医学科学院整形外科医院 整形十二科

刘 征(1986-)，女，辽宁阜新人，硕士研究生.

范 飞，100144，中国医学科学院整形外科医院 整形十二科，电子信箱：fanfeiplastics@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.07.020

R622.1

A

1673-7040(2014)07-0438-04

2014-03-10)