人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

吕卫东，李俊鑫，刘绿艳，李欣，崔璐璐，万晓春

人OX40胞外区基因的克隆、原核表达及单克隆抗体的制备

吕卫东，李俊鑫，刘绿艳，李欣，崔璐璐，万晓春

518055 深圳，中国科学院深圳先进技术研究院（吕卫东、李俊鑫、刘绿艳、万晓春）；121000 锦州，辽宁医学院基础医学院（李欣、崔璐璐）

制备抗人OX40 单克隆抗体，为进一步研究OX40/OX40L 通路以及针对该通路进行疾病干预、疾病治疗和药物筛选奠定基础。

PCR扩增人OX40 胞外区的基因序列，将其构建到原核表达载体pET-32a(+) 中，利用大肠杆菌表达系统表达OX40 胞外区蛋白，经Ni 柱纯化后获得目的蛋白。以纯化的OX40 胞外区蛋白为免疫原免疫小鼠，采用常规方法进行细胞融合，通过ELISA和多次克隆化培养，筛选出分泌特异性鼠抗人OX40 单克隆抗体的杂交瘤细胞株；通过ELISA、Western blot 和免疫荧光检测抗体的效价及特异性。

成功构建人OX40 原核表达质粒pET-32a(+)-OX40，并在BL21(DE3) 中诱导表达，经SDS-PAGE 和Western blot 鉴定、Ni 柱纯化、透析后获得OX40 胞外区蛋白；以此纯化蛋白为免疫原，成功制备具有较强亲和力的单克隆抗体。

克隆表达并纯化了人OX40 蛋白，成功制备针对该蛋白的高亲和力单克隆抗体，为进一步研究OX40/OX40L 的生物学功能奠定了实验基础。

受体，OX40； 基因表达； 抗体，单克隆

OX40（CD134）属于 TNFR 超家族成员之一，为 I 型跨膜糖蛋白，主要表达在活化的 CD4+和 CD8+T 细胞表面，其配体 OX40L 在活化的 B 细胞、树突细胞和内皮细胞上均有表达[1-2]。在机体的免疫应答过程中，OX40/OX40L 作为一对重要的共刺激分子，为 T、B 细胞的激活提供了重要的共刺激信号，其信号传导也与效应细胞存在和功能相关[3-4]。由于 OX40/OX40L 在机体的免疫应答和自身免疫性疾病的发生发展中发挥了重要作用，并随着生物学功能的进一步揭示逐渐成为临床干预自身免疫性疾病、移植排斥反应和肿瘤的一个理想靶点[5]。

1 材料与方法

1.1 主要材料

pET32a(+)、pLVX-IRES-ZsGreen、BL21(DE3)、HEK293T 细胞由本实验室保存；人 OX40 基因全长 ORF 克隆购自北京义翘神舟生物技术有限公司；DMEM 培养基、胎牛血清、HAT 及 PEG4000 购自美国 Sigma 公司；限制性核酸内切酶、Taq DNA 聚合酶、DNA 分子量标记均购自日本 Takara 公司；T4 DNA 连接酶为美国 Thermo 公司产品；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购于北京康润诚业生物科技有限公司。6~ 8 周龄 SPF 级BALB/c 雌性小鼠，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：SCXK（粤）2008-0002。

1.2 方法

1.2.1 pET32a(+)-OX40 重组质粒的构建及鉴定 以人全长 OX40 cDNA 为模板，上游引物 F：CATGAACTCCACTGTGTCGGGGACACC，下游引物 R：CCCTTAGATGGCGGCA ACCGCACG（下划线分别为I和d III酶切位点），扩增 OX40 基因。PCR 扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 50 s，52 ℃复性 35 s，72 ℃延伸 50 s，29 个循环；72 ℃延伸 5 min。PCR 产物经电泳及胶回收后连接到原核表达载体 pET32a(+) 上并转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，经I和d III双酶切鉴定的阳性克隆送至Invitrogen 公司测序。

1.2.2 OX40 蛋白的原核表达、鉴定及纯化 将测序正确的菌株接种于 3 ml LB 氨苄培养基，37 ℃振荡培养至600= 0.6 ~ 0.8，加入至终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，于 37 ℃诱导表达，4 h 后分别取菌液 1 ml 离心收集菌体，SDS-PAGE 电泳分析目的蛋白的表达情况，并用 HRP 标记的 Anti-His 抗体对其进行 Western blot 检测。

1.2.3 OX40 蛋白纯化 验证正确的阳性菌扩大培养后，离心收菌体，用 PBS 重悬后超声破碎，离心后取上清，用 0.45 μm 的滤器过滤，上样于 Ni-Seproase 6FF 亲和柱，经镍柱亲和纯化后，取少量上清液做 12% 的 SDS-PAGE 电泳验证蛋白纯化效果。其余上清液转移至超滤管中于 4 ℃条件下离心，浓缩蛋白，采用 Bradford 法测定蛋白浓度，并于–80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 OX40 免疫小鼠及滴度测定 将纯化的 OX40 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，初次免疫100 μg/只，将蛋白与弗氏完全佐剂 1:1 比例完全乳化后，皮下多点注射。间隔 2 周后，进行第 2 次免疫，将蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化后，皮下多点注射，100 μg/只。间隔 2 周后第 3 次免疫，方法同第 2 次。第 3 次免疫后眼眶取血测定抗体滴度。OX40 包被 ELISA 板，20 ng/孔，4 ℃包被过夜，5% 的脱脂奶粉 37 ℃封闭 1 h，PBS-T 洗涤 3 次后加入系列稀释的小鼠血清，37 ℃孵育 1 h，用 PBS-T 洗涤 3 次，加 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 二抗（1:8000）孵育 30 min。用 PBS-T 洗涤 3 次，TMB避光显色 10 min，2 mol/L 的硫酸终止反应，酶标仪 450 nm 测定值。

1.2.5 OX40 单克隆抗体的制备 选取滴度高的小鼠，腹腔注射 100 μg/只加强免疫，3 d 后取脾脏，采用 PEG 法与Sp2/0 细胞融合。HAT 培养基加压筛选并克隆化筛选阳性克隆，杂交瘤细胞接种 BALB/c 小鼠，制备并纯化抗 OX40 抗体。

1.2.6 免疫荧光法测定 mAb 对膜表面 OX40 的识别 将培养的 293T 细胞以 1 × 105个/ml 的细胞密度接种到放置预处理的盖玻片的 24 孔板中，利用脂质体将 pLVX-IRES-ZsGreen 及 pLVX- IRES-OX40-ZsGreen 分别转染到 293T 细胞中，于 CO2培养箱中培养 48 h。用冰冷的 PBS 洗 3 次，每次 5 min。用 3.7% 的多聚甲醛于室温固定30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min。1% BSA 室温封闭 30 min 后，加入 1% BSA 稀释的抗 OX40 单抗，于室温孵育 1 h，PBS 洗 3 次，每次 5 min。加入 1:400 稀释的 Dylight594 标记的羊抗鼠二抗于室温孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次5 min。利用抗淬灭封片剂封片后于荧光显微镜下观察。

1.2.7 Western blot 测定 mAb 对膜表面 OX40的识别特异性 利用脂质体将 pLVX-IRES-ZsGreen及 pLVX-IRES-OX40-ZsGreen 分别转染到 293T 细胞中，于 CO2培养箱中培养 48 h 后收集细胞。细胞经预冷的 RIPA 抽提后，将获得的膜蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，转膜后用 5% 脱脂奶粉于 37 ℃封闭 1 h，之后于 37 ℃用制备的单抗进行孵育，HRP 标记的羊抗鼠 IgG 抗体作为二抗，分别孵育 8F8 株，4H11 株表达上清及羊抗鼠二抗，最后用化学发光法显色。

2 结果

2.1 表达载体的构建与鉴定

以人全长 OX40 cDNA 为模板，设计上、下游引物通过 PCR 扩增 OX40 胞外区基因，1 % 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示目的片段大小为 576 bp，与预期值相符（图 1）。OX40 基因片段与原核表达载体 pET32a 经过双酶切后通过 T4 连接酶进行连接并转化 BL21（DE3）感受态细胞，挑取克隆进行菌落 PCR验证，1% 琼脂糖凝胶电泳结果显示电泳条带与预期值相符（图 2），确定表达载体 pET32a-OX40 构建正确。

bp M 1 2000 1000750500 250100

Figure 1 PCR products of the extracellular domain of OX40

bp M 1 2 3 4 5 6 7 2000 1000750500 250100

Figure 2 The clone PCR results of transformants

2.2 融合蛋白的表达及鉴定

将阳性菌于 37 ℃，0.2 mmol/L 的 IPTG 诱导表达过夜，细菌经超声波破碎后离心取上清进行 SDS-PAGE（图 3），与空载对照相比，诱导培养物在 38 kD 处有明显的条带，表达产物主要以可溶性形式存在。Western blot 分析结果显示在相对分子质量约 38 kD 处有明显条带，与预期值相符。

2.3 表达产物的纯化及 SDS-PAGE 鉴定

表达菌体经超声破碎后离心上清上样于Ni-Seproase 6FF 亲和层析柱，经200 mmol/L 咪唑磷酸盐缓冲液洗脱后得到纯化的目的蛋白（图 4），经 Bradford 法测定蛋白浓度，纯化后的 OX40 蛋白的浓度为 400 μg/ml。

Figure 3 IPTG-induced expression ofOX40

kD M 1 2 3 4 1701301007055 40 35 25 15

Figrue 4 SDS-PAGE analysis of purified OX40

2.4 OX40 抗体效价测定

纯化的 OX40 蛋白免疫 BALB/c 小鼠，第3 次免疫后眼眶取血利用间接ELISA 法测定抗OX40 抗体的效价，由图 5 可知，免疫 OX40 后，产生了高效价的抗 OX40 抗体。

2.5 单克隆抗体的制备及特异性鉴定

利用 PEG 法进行细胞融合，共融合 10 块96 孔板。将复测为阳性的克隆连续进行 2 次克隆化，获得两株稳定的抗人 OX40 的杂交瘤细胞株。间接免疫荧光检测表明，这两株单抗均能识别 293T细胞表面表达的 OX40 蛋白（图 6）。Western blot分析结果显示，这两株单抗均能与 293T 表达的OX40 蛋白特异性结合，空载对照组则无相应条带（图 7）。

OD4504.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 1234567 抗血清稀释倍数The proportion of antiserum dilution

Figure 5 The titer of antiserum determined by indirect ELISA

图 6 免疫荧光检测 OX40 单抗的特异性（1：空载对照；2：同型抗体对照；3：8F8 株；4：4H11 株）

Figure 6 Identification of OX40 mAb by immunofluorescence (1: Negative control of pLVX-IRES-ZsGreen plasmid; 2: IgG isotype control; 3: 8F8 cell line; 4: 4H11 cell line)

1 2 3

Figure 7 Western blot analysis of OX40 mAb

3 讨论

OX40/OX40L 已被证实在炎性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤及移植排斥的发生、发展过程中发挥着重要的作用[6-7]。通过对其干预所进行的免疫治疗在动物模型上已取得较好的效果[8]。干预 OX40/OX40L 途径已经作为治疗许多临床慢性炎性反应性疾病的目标之一[9-10]。

本研究通过基因工程手段克隆得到 OX40 胞外区片段并在原核细胞中高效表达，纯化后用于免疫 BALB/c 小鼠，通过杂交瘤技术、单克隆抗体筛选及抗体纯化技术获得高效价的抗 OX40 抗体。通过 ELISA 和免疫荧光鉴定所制备的单克隆抗体具有良好的特异性和高度的亲和力，为进一步研究 OX40/OX40L 的生物学活性及进一步寻找针对 OX40/OX40L 通路的治疗药物奠定了实验基础。

目前对于 OX40 分子抗肿瘤机制的研究还处于起步阶段，但已有的实验结果是振奋人心的[11]。将 OX40 分子作为肿瘤免疫治疗的新靶点已显现出了积极的作用。而抗人 OX40mAb 的成功研制，为深入研究 OX40/OX40L 分子的作用以及信号通路提供了有力的新工具[12]。相信随着对 OX40 分子研究的深入，将会为协同刺激分子在肿瘤及其他疾病的免疫学治疗等方面提供更有价值的线索和帮助。

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Prokaryotic expression of the extracellular region of human OX40 and preparation of its antibody

LÜ Wei-dong, LI Jun-xin, LIU Lü-yan, LI Xin, CUI Lu-lu, WAN Xiao-chun

To prepare novel anti-OX40 functional monoclonal antibodies and characterize their distinct biological functions.

The gene fragment of extracellular region of OX40 was amplified by PCR and cloned into pET-32a(+) prokaryotic expressing vector. The expressed products were purified by Ni sepharose and identified by Western blot. The purified recombinant protein was used as antigen to immunize BALB/c mice. Then the immunized spleen cells were isolated from immunized mice and fuse with Sp2/0, a kind of myloma. After screening by ELISA, hybridomas secreting anti-OX40 mAb were acquired and used to generate specific Abs. At last, biological activities of Abs were investigated by ELISA, Western blot.

The recombinant OX40 extracellular domain protein was successfully expressed in BL21 and purified by Ni sepharose. It was a protein with about 38 kD molecular weight as analyzed by SDS-PAGE and Western blot. The data of FACS demonstrated that the antiserum had high affinity to OX40 expressed on the membrane of OX40-transfected cells.

The purified protein OX40 has been successfully obtained. The prepared monoclonal antibody shows high specificity and titer in immunized mice. The preparation of recombinant OX40 and its monoclonal antibody has provided reliable tools for the future study on the biologic activity of OX40/OX40L.

Receptors, OX40; Gene expression; Antibodies, monoclonal

WAN Xiao-chun, Email: xc.wan@siat.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.006

深圳市孔雀计划团队引进资助项目（Y2A206）

万晓春，Email：xc.wan@siat.ac.cn

2014-07-08

Author Affiliations: Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Shenzhen 518055, China (LÜ Wei-dong, LI Jun-xin, LIU Lü-yan, WAN Xiao-chun); College of Basic Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou121000, China (LI Xin, CUI Lu-lu)