pH响应两亲性壳聚糖衍生物的合成与表征

于妙卓，费学宁，张宝莲，李旭坤，茈梦雨

(天津城建大学 a. 材料科学与工程学院；b. 理学院，天津 300384)

壳聚糖作为一种天然聚合物，具有生物相容性、生物可降解性、低免疫原性和低生物活性等良好的生物学性质[1-2].文献报道，两亲性壳聚糖衍生物形成的胶束可成功对疏水性药物进行增溶.

为了提高药物治疗的有效应和安全性，提高药物的生物利用度，降低对人体正常组织的损伤，“智能型”聚合物胶束引起了科研人员的广泛兴趣.大多数实体瘤的 pH值(pH＜6.5)都低于周围正常组织(pH=7.5)，利用这种变化可设计 pH敏感的释药系统.此外，肿瘤细胞内涵体和溶酶体的 pH值(pH=5.0～6.0)要明显低于细胞外pH值，当胶束进入细胞后响应其pH环境的变化，从而使释药增加实现亚细胞器的靶向释药[3-5].向聚合物中引入pH敏感基团，通过在不同pH介质中胶束结构的改变致使胶束亲水性被破坏而释放药物[6].据文献报道[7]，质子化的聚合物即带胺基、吡啶或者咪唑基等碱性基团的弱碱性聚合物或带羧酸基团的弱酸性聚合物，当pH值发生改变时，这类聚合物的离子化状态也发生改变，导致它们在水中的溶解性发生变化.其中带羧基的弱酸性聚合物在酸性条件下质子化后不溶于水，而在碱性条件下溶于水.

本文以低分子量壳聚糖为主链，与辛醛通过还原席夫碱的方法引入了疏水长链烷基，并在酸性条件下用琥珀酸酐改性，合成了两亲性壳聚糖衍生物.研究了此聚合物在水中自聚集现象和在不同pH介质中的行为变化.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

壳聚糖(分子量＜5000，脱乙酰度＞85%)，济南海得贝海洋生物有限公司；辛醛(纯度≥99.0%)，硼氢化钠(纯度≥98.0%)，甲基磺酸，天津市光复精细化工研究所；琥珀酸酐，天津市博迪化工有限公司；芘(98%)，阿法埃莎(天津)化学有限公司；其余试剂均为分析纯.

Thermo Nicolet380傅里叶红外变换光谱仪，美国Thermo Fisher Nicole公司；日立F-7000荧光分光光度计，美国 VARIAN公司；紫外分光光度计，美国TA公司；ZS90 ZETA纳米粒径电位分析仪，英国Malvern公司；Q20差示扫描量热仪，美国PerkinElmer公司.

1.2 实验方法

1.2.1 N-辛基壳聚糖制备

CS(壳聚糖＜5 kDa，4.0 g)在三口瓶中溶于无水甲醇(120 mL)，置于30 ℃水浴中不断机械搅拌，向体系缓慢滴加辛醛(11.3 mL)，滴加完毕后保温反应36 h.向体系分10批次加入NaBH4(3 g)，室温还原反应24 h，用1 mol/L的 NaOH调反应液pH至中性，抽滤，滤饼依次用甲醇、水洗涤，真空干燥得淡黄色粉末.

1.2.2 N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖制备

称取0.8 g干燥的N-辛基壳聚糖，加入15 mL甲基磺酸，冰水浴中不断机械搅拌20 min，逐滴滴加丁二酸酐/丙酮溶液，剧烈机械搅拌反应3 h，反应结束后移入100 mL烧杯，于-20 ℃冷冻过夜，反应液在丙酮中沉淀，抽滤获得沉淀，沉淀在蒸馏水中溶解，用氨水调节 pH至 7.0，沉淀再次析出，抽滤，真空干燥，干燥后的沉淀用丙酮索氏抽提24 h，真空干燥得到黄褐色粉末.

1.3 N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖的结构表征

使用 FTIR 380红外光谱仪测定产物的红外光谱；使用 Q20差示扫描量热仪测定产物的 DSC.升温速率 15 ℃/min，起始温度 25 ℃，终止温度350 ℃.

1.4 N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖胶束性能测试

1.4.1 临界胶束浓度(CMC)测定

采用稳态芘探针法测定胶束CMC.

1.4.2 胶束紫外透光度和粒径测定

分别取1 mL的N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖溶液，质量浓度为10 mg/ mL，加入到8 mL的pH值分别为 4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5的磷酸盐缓冲溶液中.用ZETA纳米粒径电位分析仪测定胶束粒径，用紫外-可见分光光度计测定 500 nm 处的透光率，使用粒径和透光率综合评价 N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖的pH敏感性.

2 结果与讨论

2.1 N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖的结构表征

2.1.1 壳聚糖，N-辛基壳聚糖，N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖红外光谱

图1是壳聚糖，N-辛基壳聚糖，N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖的红外谱图.

由图1可以得到，在N-辛基壳聚糖红外谱图中的2925.30 cm-1，2856.74 cm-1处的吸收峰是辛基碳链伸缩振动峰，表明辛基成功接枝在壳聚糖上，而1652.31 cm-1处吸收峰相比于壳聚糖峰减小，表明消耗了氨基，证明辛基接枝于壳聚糖的氨基上.在 N-辛基-O N-琥珀化壳聚糖红外光谱中 768.40 cm-1处是C—H苯环面外振动吸收峰.1059.48 cm-1处有强吸收峰是 C—O—C的骨架振动峰.1652.31 cm-1处的吸收峰是氨基吸收峰，强度依次减小，证明氨基数量大幅减少，这是由于接枝辛基和琥珀酸酐消耗了大量的—NH2基.1400.75 cm-1处有强吸收峰是 C—O振动峰证明含有羧酸，证明是琥珀酸酐开环后另一边形成的羧基.在1196.26 cm-1处有强吸收峰，此峰为酯基吸收峰，证明丁二酸酐接枝在壳聚糖 6位的羟基上形成酯基.综合上述，可知辛醛接枝在壳聚糖的—NH2上，琥珀酸酐接枝在壳聚糖的—NH2及6位亚甲基的—OH上，使其形成N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖的两亲性结构.

图1 壳聚糖，N-辛基壳聚糖，N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖红外光谱(由上至下)

2.1.2 DSC分析

图2中是壳聚糖，N-辛基壳聚糖，N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖的DSC曲线图.

图2 壳聚糖，N-辛基壳聚糖，N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖DSC曲线

图2中曲线a为壳聚糖DSC曲线，在102.87 ℃有吸热峰，为游离水的去除峰，壳聚糖在 218.44 ℃时有放热峰，为壳聚糖分解.在 225.44 ℃时有尖锐吸热峰，为壳聚糖熔融峰.曲线b为N-辛基壳聚糖在 303.43 ℃有一强的放热峰，可能由于接枝的辛基开始断裂产生的，225.44 ℃无壳聚糖熔融吸热峰 说明在—NH2基上引入取代基后，结晶能力下降，从有序变得无序.曲线 c为 N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖在 258.60 ℃有一放热峰，为壳聚糖羟基位所接琥珀酸酐分解产生的.低于N-辛基壳聚糖的放热峰位置(303.43 ℃)，说明接枝琥珀酰基后热稳定性降低，225.44 ℃无壳聚糖熔融吸热峰酰基，说明接枝取代后，结晶能力下降，从有序变得无序.

2.2 N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖胶束性能测试

2.2.1 临界胶束浓度CMC分析

利用稳态芘作为荧光探针法测定壳聚糖临界胶束质量浓度值为0.072 mg/mL.

2.2.2 pH敏感性分析

笔者期望 N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖能够形成稳定的胶束在体内循环，当到达靶细胞(肿瘤细胞)的溶酶体(pH＝5.0)或内涵体(pH＝6.0)时，使亲水外层能够响应酸性环境水解而断裂，释放包载的药物.由于正常组织pH值(pH＝7.5)比肿瘤组织的pH值(pH＝6.3～6.8)高，因此本研究考察了比较宽范围的 pH 环境(pH 取 4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0 和 7.5).表1为N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖在不同pH环境下的平均粒径.

由表1可看出不同pH条件下N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖粒径差别明显.中性和弱碱性介质中，胶束结构完整尺寸较小，保持在500 nm以下；随着pH的继续降低，在pH＜5.5时胶束粒径急剧增大，胶束结构破坏.这一现象说明壳聚糖胶束在不同pH环境下胶束的亲水性发生变化，胶束团膨胀程度不同导致粒径不同[8].在pH为4.5～5.5之间，壳聚糖胶束结构被破坏.图3为不同pH条件下N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖溶液的粒径与透光率.

表1 N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖在不同pH环境的平均粒径

图3 不同pH条件N-辛基-O,N-琥珀酰化壳聚糖溶液的粒径与透光率

由图3可以看出，不同pH缓冲液条件下，随着pH 值的下降 N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖溶液在pH值4.5～5.5之间透光率急剧减小，粒径增大，说明N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖胶束结构破坏[9].综上所述，N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖具有pH敏感性，pH敏感范围为4.5～5.5.

理想的载药胶束在体循环中应尽量不释放药物，到达靶组织后有效地释放药物.本文合成了带有羧酸基团的弱酸性聚合物，该质子化聚合物在生理pH条件下稳定，而进入肿瘤细胞后，随着内涵体中pH的降低，聚合物的离子化状态发生改变而使其溶解性随之发生变化.带羧基的弱酸性聚合物在酸性条件下质子化后不溶于水，胶束结构被破坏从而释放药物，使肿瘤细胞内药物浓度增加，降低了抗肿瘤药物的不良反应.

3 结 语

本文通过低分子量壳聚糖的烷基化和酰基化，合成了具有pH敏感性的两亲性壳聚糖衍生物N-辛基-O N-琥珀酰化壳聚糖，pH敏感范围为4.5～5.5，为肿瘤靶向载体的制备提供了理论和实践基础.

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