SFE—CO2法与SD法提取杜仲叶挥发油成分的比较

贾智若+李兵+朱小勇+蔡少芳+胡凌青

摘要：分别采用超临界CO2流体萃取法（SFE-CO2法）与水蒸气蒸馏法（SD法）从杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）叶中提取挥发油，并结合气相色谱-质谱仪（GC-MS）对其进行检测。从SFE-CO2法提取的杜仲叶挥发油中共鉴定出59种成分，占挥发油总量的82.57%；从SD法提取的杜仲叶挥发油中共鉴定出39种成分，占挥发油总量的84.48%。两种提取方法得到的挥发油组分及其含量差异较大。SFE-CO2法比SD法能更真实、全面的反映杜仲叶药材的挥发油成分。

关键词： 杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）；挥发油；超临界CO2萃取法（SFE-CO2法）；水蒸气蒸馏法（SD法）；GC-MS

中图分类号：O657.63 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3625-04

Comparison of Chemical Components in the Volatile Oil from Eucommia ulmoides Oliv. Leaf Extracted by Supercritical CO2 Fluid and Steam Distillation Method

JIA Zhi-ruo，LI Bing，ZHU Xiao-yong，CAI Shao-fang，HU Ling-qing

（Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China）

Abstract： The volatile oil was extracted from Eucommia ulmoides Oliv. leaf by supercritical fluid CO2 extraction （SFE-CO2） and steam distillation（SD） and detected with GC-MS. The results showed that 59 components in the volatile oil form Eucommia ulmoides Oliv. leaf were identified by SFE-CO2 method and 39 components by SD method， accounting for 82.57% and 84.48% of the total volatile oil，respectively. The chemical constituents and their contents of volatile oil extracted by two methods were significantly different. The volatile oil extracted by SFE-CO2 can truly and comprehensively reflect the chemical components in Eucommia ulmoides Oliv. leaf more truly and comprehensirely.

Key words： Eucommia ulmoides Oliv.； volatile oil； supercritical CO2 fluid extraction； steam distillation； GC-MS

收稿日期：2013-09-02

基金项目：广西卫生厅科技创新项目（Z2013203）

作者简介：贾智若（1979-），女（满族），辽宁抚顺人，讲师，在读博士研究生，研究方向为中药药效物质基础质量标准化，（电话）0771-3137585

（电子信箱） jzr7929@163.com。

杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）是杜仲科杜仲属的落叶乔木，始载于《神农本草经》，列为上品，具有补中益气、强筋骨、抗衰老、降血压等功效。传统以皮入药，但由于杜仲皮生长周期长，仅以皮作为药源会使资源紧缺。现代科学研究证实杜仲叶和皮化学成分基本一致，与皮具有同等功效，可以叶代皮入药[1-5]。随着人们对杜仲叶有效成分和药理作用的研究不断深入，杜仲叶的各种药用功效逐渐为人们所重视，已成为当今药用及保健品领域开发的热点，目前已开发的产品有杜仲胶囊、杜仲平压片、杜仲壮骨丸、杜仲茶等[4]，杜仲叶将成为21世纪人类保健食品的重要植物资源之一，因此对杜仲叶药用成分进行分析具有重要意义。

本研究采用超临界CO2萃取法（SFE-CO2法）与水蒸气蒸馏法（SD法）两种方法对四川绵阳产杜仲叶进行挥发油提取，运用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对其化学成分进行定性定量分析，比较二者挥发性成分的差异，以期为更好地开发利用杜仲叶资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验样品来自四川绵阳，自然晒干，经广西中医药大学药用植物教研室梁子宁副教授鉴定为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoids Oliv.）的干燥叶。

1.2 仪器

美国HP6890/5973N气相-质谱联用仪（美国Agilent公司）；HP-5MS弹性毛细管柱（30.0 m×250 μm×0.25 μm）；超临界CO2萃取装置（杭州黎泵业有限公司）；挥发油提取器（自制）；LG16-W高速微量离心机（北京医用离心机厂）。

1.3 方法

1.3.1 杜仲叶挥发油的提取 1）SFE-CO2法：称取四川绵阳产干燥杜仲叶100 g粉碎，过筛，置于超临界CO2流体萃取池中。萃取釜压力20 MPa，温度50 ℃；分离釜Ⅰ压力5.5 MPa ，温度40 ℃；分离釜Ⅱ压力6 MPa，温度35 ℃；萃取时间1 h，CO2流量10 L/h，得到有特殊香味的棕黄色油状物，产率为3.83%。2）SD法：称取上述杜仲叶100 g，粉碎，过筛，按固液比1∶6加入600 mL去离子水，浸泡2 h后连接挥发油提取器，加热回流5 h，收集挥发油，馏出液用乙醚萃取，无水硫酸钠干燥，回收溶剂得到少许具有特殊香味的棕黄色挥发油。endprint

1.3.2 供试品溶液的制备 取上述SFE-CO2法萃取样品和SD法萃取样品各适量，分别加乙醚溶解并稀释，经无水硫酸钠干燥后得棕黄色溶液，待测。

1.3.3 色谱-质谱条件 HP-5MS毛细管柱（30.0 m×250 μm×0.5 μm）；程序升温，初始温度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至温度250 ℃，保持3 min；进样口温度为250 ℃；载气为高纯氦气，流量为1.0 mL/min；进样量为1.0 μL；分流比为10∶1。

质谱接口温度为280 ℃；EI电离方式，电子轰击能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；倍增电压 1 247 V；扫描范围45～550 amu；扫描间歇2.94 次/s；溶剂延时3 min。

1.3.4 杜仲叶挥发油样品的化学成分分析 按上述GC-MS条件对两种杜仲叶挥发油样品进行分析，得总离子流图，见图1和图2。所得色谱和质谱信息经计算机数据处理系统进行自动检索，通过与标准质谱图库（NIST02，Wiley275）对照和解析，对杜仲叶挥发油成分进行确认，并用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量，化学成分分析结果见表1。

2 结果与分析

用SFE-CO2法和SD法提取得到的杜仲叶挥发油均具有特殊的浓郁香味，前者外观颜色为棕黄色，后者颜色略深。SFE-CO2法与SD法所得挥发油相比，收率大为提高，可达3.83%。

两种方法提取得到的杜仲叶挥发油样品主要化学成分差异较大。从SD法提取的杜仲叶挥发油中初步鉴定出39种成分，占挥发油总峰面积的84.48%；其中含量较高成分主要有3-呋喃甲醇乙酸酯、肉桂酸乙酯、β-紫罗酮、α-紫罗酮、香叶基丙酮、金合欢烷、2，4-二叔丁基-4-甲基苯酚、棕榈酸、法尼基丙酮、植酮、棕榈酸甲酯、植醇等。从SFE-CO2法所得挥发油样品中初步鉴定出59种成分，占挥发油总峰面积的82.57%，其中含量较高的成分主要有右旋龙脑、肉桂酸乙酯、榄香烯、异丁子香烯、石竹烯、δ-杜松烯、对甲氧基肉桂酸乙酯、牻牛儿酮、棕榈酸乙酯、植醇、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯等。两种挥发油样品中仅有4-萜烯醇、α-松油醇、二氢猕猴桃内酯、β-二氢大马酮、左旋乙酸冰片酯、榄香烯、棕榈酸甲酯、叶绿醇等19种成分相同，但各成分的含量有差异。而SFE-CO2法所得挥发油中含量较高的右旋龙脑、异丁子香烯、蛇床烯、（6R，7E，9R）-9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮、牻牛儿酮、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等成分，在SD法中并未检出。

3 小结与讨论

近年来对杜仲叶的研究工作不断深入，但对杜仲叶挥发油化学成分的研究较少，且提取方法均采用传统的SD法，提取率低[6，7]。杜仲主产于四川、陕西、河南、贵州、云南等省，其中以川杜仲品质最优，为道地药材[8]。因此本研究首次采用SFE-CO2法与SD法对四川绵阳产杜仲叶进行挥发油提取，并结合GC-MS技术对其化学成分进行对比分析研究，结果显示两种提取方法所得的挥发油组分与含量相差较大，SFE-CO2法提取率更高，挥发油组分更为丰富，由该法提取得到的右旋龙脑、异丁子香烯、蛇床烯、牻牛儿酮等萜烯及其含氧衍生物以及棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等有机酸酯类成分，在SD法中均未检出。传统的SD法操作简单，成本低，但由于提取过程中加热时间长，提取温度高，一些低沸点组分容易挥发流失，一些敏感组分也可能分解或变性，此外挥发油中一些含氧萜烯类化合物，因微溶于水而不易提取出来，从而影响挥发油的品质和收率。SFE-CO2法是一种近年来应用较为广泛的新型萃取分离技术，与传统方法相比，萃取条件温和，可避免一些挥发油成分的热解及挥发[9，10]。SFE-CO2法提取的挥发油比SD法能更真实、全面地反映杜仲叶药材中的挥发性化学成分。

参考文献：

[1] 晏 媛，郭 丹. 杜仲叶的化学成分及药理活性研究进展[J]. 中成药，2003，25（6）：491-492.

[2] 叶文峰.杜仲叶中化学成分、药理活性及应用研究进展[J].林产化工通讯，2004，38（5）：40-44.

[3] 艾伦强，李婷婷，何银生，等.杜仲的应用研究进展[J].亚太传统医药，2010，6（10）：163-165.

[4] 程光丽.杜仲有效成分分析及药理学研究进展[J].中成药， 2006，28（5）：723-725.

[5] 龚桂珍，宫本红，张学俊，等. 杜仲叶和杜仲皮中化学成分的比较[J]. 西南大学学报（自然科学版）， 2010， 32（7）：165-172.

[6] 巩 江， 倪士峰， 路 峰， 等. 杜仲叶挥发物质气相色谱-质谱研究[J]. 安徽农业科学， 2010， 38 （17）： 8998-8999.

[7] 黄相中，张润芝，关小丽，等.云南楚雄杜仲叶挥发油的化学成分分析[J].云南民族大学学报（自然科学版），2011，5（20）：356-359.

[8] 叶 萌， 郭东力， 罗承德. 四川“三木药材”的产业化探讨[J]. 四川林业科技， 2006， 27（3）：88-90.

[9] 廉宜君，李元元，李 敏，等. 超临界CO2萃取和水蒸气蒸馏法萃取沙枣花挥发油工艺的比较研究[J].中国中医药信息杂志， 2010，17（1）：51-53.

[10] 杨 明，余德顺，田戈夫，等.超临界CO2萃取与水蒸气蒸馏提取姜油的GC-MS分析[J].贵州化工，2011，36（3）：34-47.endprint

1.3.2 供试品溶液的制备 取上述SFE-CO2法萃取样品和SD法萃取样品各适量，分别加乙醚溶解并稀释，经无水硫酸钠干燥后得棕黄色溶液，待测。

1.3.3 色谱-质谱条件 HP-5MS毛细管柱（30.0 m×250 μm×0.5 μm）；程序升温，初始温度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至温度250 ℃，保持3 min；进样口温度为250 ℃；载气为高纯氦气，流量为1.0 mL/min；进样量为1.0 μL；分流比为10∶1。

质谱接口温度为280 ℃；EI电离方式，电子轰击能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；倍增电压 1 247 V；扫描范围45～550 amu；扫描间歇2.94 次/s；溶剂延时3 min。

1.3.4 杜仲叶挥发油样品的化学成分分析 按上述GC-MS条件对两种杜仲叶挥发油样品进行分析，得总离子流图，见图1和图2。所得色谱和质谱信息经计算机数据处理系统进行自动检索，通过与标准质谱图库（NIST02，Wiley275）对照和解析，对杜仲叶挥发油成分进行确认，并用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量，化学成分分析结果见表1。

2 结果与分析

用SFE-CO2法和SD法提取得到的杜仲叶挥发油均具有特殊的浓郁香味，前者外观颜色为棕黄色，后者颜色略深。SFE-CO2法与SD法所得挥发油相比，收率大为提高，可达3.83%。

两种方法提取得到的杜仲叶挥发油样品主要化学成分差异较大。从SD法提取的杜仲叶挥发油中初步鉴定出39种成分，占挥发油总峰面积的84.48%；其中含量较高成分主要有3-呋喃甲醇乙酸酯、肉桂酸乙酯、β-紫罗酮、α-紫罗酮、香叶基丙酮、金合欢烷、2，4-二叔丁基-4-甲基苯酚、棕榈酸、法尼基丙酮、植酮、棕榈酸甲酯、植醇等。从SFE-CO2法所得挥发油样品中初步鉴定出59种成分，占挥发油总峰面积的82.57%，其中含量较高的成分主要有右旋龙脑、肉桂酸乙酯、榄香烯、异丁子香烯、石竹烯、δ-杜松烯、对甲氧基肉桂酸乙酯、牻牛儿酮、棕榈酸乙酯、植醇、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯等。两种挥发油样品中仅有4-萜烯醇、α-松油醇、二氢猕猴桃内酯、β-二氢大马酮、左旋乙酸冰片酯、榄香烯、棕榈酸甲酯、叶绿醇等19种成分相同，但各成分的含量有差异。而SFE-CO2法所得挥发油中含量较高的右旋龙脑、异丁子香烯、蛇床烯、（6R，7E，9R）-9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮、牻牛儿酮、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等成分，在SD法中并未检出。

3 小结与讨论

近年来对杜仲叶的研究工作不断深入，但对杜仲叶挥发油化学成分的研究较少，且提取方法均采用传统的SD法，提取率低[6，7]。杜仲主产于四川、陕西、河南、贵州、云南等省，其中以川杜仲品质最优，为道地药材[8]。因此本研究首次采用SFE-CO2法与SD法对四川绵阳产杜仲叶进行挥发油提取，并结合GC-MS技术对其化学成分进行对比分析研究，结果显示两种提取方法所得的挥发油组分与含量相差较大，SFE-CO2法提取率更高，挥发油组分更为丰富，由该法提取得到的右旋龙脑、异丁子香烯、蛇床烯、牻牛儿酮等萜烯及其含氧衍生物以及棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等有机酸酯类成分，在SD法中均未检出。传统的SD法操作简单，成本低，但由于提取过程中加热时间长，提取温度高，一些低沸点组分容易挥发流失，一些敏感组分也可能分解或变性，此外挥发油中一些含氧萜烯类化合物，因微溶于水而不易提取出来，从而影响挥发油的品质和收率。SFE-CO2法是一种近年来应用较为广泛的新型萃取分离技术，与传统方法相比，萃取条件温和，可避免一些挥发油成分的热解及挥发[9，10]。SFE-CO2法提取的挥发油比SD法能更真实、全面地反映杜仲叶药材中的挥发性化学成分。

参考文献：

[1] 晏 媛，郭 丹. 杜仲叶的化学成分及药理活性研究进展[J]. 中成药，2003，25（6）：491-492.

[2] 叶文峰.杜仲叶中化学成分、药理活性及应用研究进展[J].林产化工通讯，2004，38（5）：40-44.

[3] 艾伦强，李婷婷，何银生，等.杜仲的应用研究进展[J].亚太传统医药，2010，6（10）：163-165.

[4] 程光丽.杜仲有效成分分析及药理学研究进展[J].中成药， 2006，28（5）：723-725.

[5] 龚桂珍，宫本红，张学俊，等. 杜仲叶和杜仲皮中化学成分的比较[J]. 西南大学学报（自然科学版）， 2010， 32（7）：165-172.

[6] 巩 江， 倪士峰， 路 峰， 等. 杜仲叶挥发物质气相色谱-质谱研究[J]. 安徽农业科学， 2010， 38 （17）： 8998-8999.

[7] 黄相中，张润芝，关小丽，等.云南楚雄杜仲叶挥发油的化学成分分析[J].云南民族大学学报（自然科学版），2011，5（20）：356-359.

[8] 叶 萌， 郭东力， 罗承德. 四川“三木药材”的产业化探讨[J]. 四川林业科技， 2006， 27（3）：88-90.

[9] 廉宜君，李元元，李 敏，等. 超临界CO2萃取和水蒸气蒸馏法萃取沙枣花挥发油工艺的比较研究[J].中国中医药信息杂志， 2010，17（1）：51-53.

[10] 杨 明，余德顺，田戈夫，等.超临界CO2萃取与水蒸气蒸馏提取姜油的GC-MS分析[J].贵州化工，2011，36（3）：34-47.endprint

1.3.2 供试品溶液的制备 取上述SFE-CO2法萃取样品和SD法萃取样品各适量，分别加乙醚溶解并稀释，经无水硫酸钠干燥后得棕黄色溶液，待测。

1.3.3 色谱-质谱条件 HP-5MS毛细管柱（30.0 m×250 μm×0.5 μm）；程序升温，初始温度70 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至140 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min升至温度250 ℃，保持3 min；进样口温度为250 ℃；载气为高纯氦气，流量为1.0 mL/min；进样量为1.0 μL；分流比为10∶1。

质谱接口温度为280 ℃；EI电离方式，电子轰击能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；倍增电压 1 247 V；扫描范围45～550 amu；扫描间歇2.94 次/s；溶剂延时3 min。

1.3.4 杜仲叶挥发油样品的化学成分分析 按上述GC-MS条件对两种杜仲叶挥发油样品进行分析，得总离子流图，见图1和图2。所得色谱和质谱信息经计算机数据处理系统进行自动检索，通过与标准质谱图库（NIST02，Wiley275）对照和解析，对杜仲叶挥发油成分进行确认，并用峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量，化学成分分析结果见表1。

2 结果与分析

用SFE-CO2法和SD法提取得到的杜仲叶挥发油均具有特殊的浓郁香味，前者外观颜色为棕黄色，后者颜色略深。SFE-CO2法与SD法所得挥发油相比，收率大为提高，可达3.83%。

两种方法提取得到的杜仲叶挥发油样品主要化学成分差异较大。从SD法提取的杜仲叶挥发油中初步鉴定出39种成分，占挥发油总峰面积的84.48%；其中含量较高成分主要有3-呋喃甲醇乙酸酯、肉桂酸乙酯、β-紫罗酮、α-紫罗酮、香叶基丙酮、金合欢烷、2，4-二叔丁基-4-甲基苯酚、棕榈酸、法尼基丙酮、植酮、棕榈酸甲酯、植醇等。从SFE-CO2法所得挥发油样品中初步鉴定出59种成分，占挥发油总峰面积的82.57%，其中含量较高的成分主要有右旋龙脑、肉桂酸乙酯、榄香烯、异丁子香烯、石竹烯、δ-杜松烯、对甲氧基肉桂酸乙酯、牻牛儿酮、棕榈酸乙酯、植醇、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯、邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯等。两种挥发油样品中仅有4-萜烯醇、α-松油醇、二氢猕猴桃内酯、β-二氢大马酮、左旋乙酸冰片酯、榄香烯、棕榈酸甲酯、叶绿醇等19种成分相同，但各成分的含量有差异。而SFE-CO2法所得挥发油中含量较高的右旋龙脑、异丁子香烯、蛇床烯、（6R，7E，9R）-9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮、牻牛儿酮、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等成分，在SD法中并未检出。

3 小结与讨论

近年来对杜仲叶的研究工作不断深入，但对杜仲叶挥发油化学成分的研究较少，且提取方法均采用传统的SD法，提取率低[6，7]。杜仲主产于四川、陕西、河南、贵州、云南等省，其中以川杜仲品质最优，为道地药材[8]。因此本研究首次采用SFE-CO2法与SD法对四川绵阳产杜仲叶进行挥发油提取，并结合GC-MS技术对其化学成分进行对比分析研究，结果显示两种提取方法所得的挥发油组分与含量相差较大，SFE-CO2法提取率更高，挥发油组分更为丰富，由该法提取得到的右旋龙脑、异丁子香烯、蛇床烯、牻牛儿酮等萜烯及其含氧衍生物以及棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等有机酸酯类成分，在SD法中均未检出。传统的SD法操作简单，成本低，但由于提取过程中加热时间长，提取温度高，一些低沸点组分容易挥发流失，一些敏感组分也可能分解或变性，此外挥发油中一些含氧萜烯类化合物，因微溶于水而不易提取出来，从而影响挥发油的品质和收率。SFE-CO2法是一种近年来应用较为广泛的新型萃取分离技术，与传统方法相比，萃取条件温和，可避免一些挥发油成分的热解及挥发[9，10]。SFE-CO2法提取的挥发油比SD法能更真实、全面地反映杜仲叶药材中的挥发性化学成分。

参考文献：

[1] 晏 媛，郭 丹. 杜仲叶的化学成分及药理活性研究进展[J]. 中成药，2003，25（6）：491-492.

[2] 叶文峰.杜仲叶中化学成分、药理活性及应用研究进展[J].林产化工通讯，2004，38（5）：40-44.

[3] 艾伦强，李婷婷，何银生，等.杜仲的应用研究进展[J].亚太传统医药，2010，6（10）：163-165.

[4] 程光丽.杜仲有效成分分析及药理学研究进展[J].中成药， 2006，28（5）：723-725.

[5] 龚桂珍，宫本红，张学俊，等. 杜仲叶和杜仲皮中化学成分的比较[J]. 西南大学学报（自然科学版）， 2010， 32（7）：165-172.

[6] 巩 江， 倪士峰， 路 峰， 等. 杜仲叶挥发物质气相色谱-质谱研究[J]. 安徽农业科学， 2010， 38 （17）： 8998-8999.

[7] 黄相中，张润芝，关小丽，等.云南楚雄杜仲叶挥发油的化学成分分析[J].云南民族大学学报（自然科学版），2011，5（20）：356-359.

[8] 叶 萌， 郭东力， 罗承德. 四川“三木药材”的产业化探讨[J]. 四川林业科技， 2006， 27（3）：88-90.

[9] 廉宜君，李元元，李 敏，等. 超临界CO2萃取和水蒸气蒸馏法萃取沙枣花挥发油工艺的比较研究[J].中国中医药信息杂志， 2010，17（1）：51-53.

[10] 杨 明，余德顺，田戈夫，等.超临界CO2萃取与水蒸气蒸馏提取姜油的GC-MS分析[J].贵州化工，2011，36（3）：34-47.endprint