青葙子苷A对AHNP诱导肝损伤的保护作用研究

李洪亮+程齐来+孙立波+黄志勤

摘要：为研究青葙子苷A对大鼠急性出血性坏死性胰腺炎（AHNP）诱导肝损伤的治疗作用及其初步作用机制，应用逆行胰胆管术注射牛磺胆酸钠（TAC）复制了AHNP试验动物模型，将其分为假手术组（A组）、AHNP生理盐水对照组（B组）、AHNP青葙子苷A高、低剂量治疗组（C、D组）和AHNP奥曲肽治疗组（阳性药物对照，E组）。各组试验动物手术后6 h处死，测定腹水量，运用比色法检测其血清淀粉酶含量，ELISA法测定肝组织中TNF-α含量，HE染色观察其肝组织病理变化，透射电镜观察肝脏卵圆细胞形态变化，Western-Blot检测肝组织中细胞核转录因子（NF-кB）蛋白的表达情况。结果表明，与A组比较，AHNP生理盐水对照组（B组）大鼠肝组织中腹水量、血清淀粉酶含量、TNF-α含量明显升高，NF-кB蛋白表达明显增强；青葙子苷A治疗组（C、D组）和奥曲肽治疗组（E组）肝组织中腹水量、血清淀粉酶含量、TNF-α含量及NF-кB蛋白表达均较B组显著（P<0.05）降低。说明青葙子苷A对AHNP诱导的肝损伤有显著的保护作用，其机制可能是通过抑制胰弹性蛋白酶的分泌与激活，抑制NF-кB表达，降低炎症反应，从而减轻肝损伤。

关键词：青葙子苷A；急性出血性坏死性胰腺炎（AHNP）；NF-кB；肝损伤

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）15-3588-03

Protective Effects of Celosin-A on the AHNP-induced Liver Injury

LI Hong-liang1， CHEN Qi-lai1，2， SUN Li-bo3，HUANG Zhi-qin1

（1. School of Pharmacy， Gannan Medical College， Ganzhou 341000， Jiangxi， China；2. Hunan University of Chinese Medicine，

Changsha 410208， China； 3.Qingdao University Affiliated Hospital， Qingdao 266001， Shandong， China）

Abstract： The therapeutical effect of Celosin-A on liver injury of rats caused by acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis（AHNP） were investigated and the potential mechanism of AHNP animal was studied by injecting TAC with retrograde cholangiopancreatography divided into five groups including sham operation group （A）， AHNP saline control group（B group）， treatment group in high and low dosage of Celosin-A （C and D group）， AHNP control group treated with Octreotide （E group， positive drug control）. All animals in each group were executed after 6h of surgery and measured its volume of ascites， content of serum amylase， TNF-α content in liver tissue with colorimetry and ELSIA method. The liver pathological changes were observed by HE dye. The hepatic oval cells morphology was observed under transmission electron microscope. The expression of NF-кB were detected by Westeen-Blot method. The results showed that the volume of ascites， content of serum amylase and TNF-α in AHNP saline control group（B group） were obviously higher than those in group A. The expression of NF-кB was obviously strengthened. Compared with AHNP saline control group（B group） the volume of ascites， content of serum amylase and TNF-α ，NF-кB expression -in group C， D and E were all significantly lower（P<0.05）. It is indicated that the Celosin-A had significant protective effect on AHNP-induced liver injury. Liver injury might be alleviated through inhabiting the activation and secretion of pancreatic elastase to inhabit the expression of NF-кB and reduce inflammation.endprint

Key words： celosin-A； acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis； NF-кB； liver injury

收稿日期：2014-02-19

基金项目：江西省自然科学基金项目（2012ZBAB205006）；江西省教育厅科技计划项目（GJJ13676）；赣南医学院院级资助项目（YB201205）

作者简介：李洪亮（1983-），男，江西赣州人，讲师，主要从事药理学研究，（电话）18970786132（电子信箱）zhonglishidatou@126.com；通讯作者，

黄志勤，副教授，硕士生导师，主要从事天然药物学研究，（电子信箱）zhonglishidatou@126.com。

青葙子（Semen celosiae）为苋科植物青葙（Celosia argentea L.）的干燥成熟种子，主要分布于江西、福建、广东等地。青葙子是一味常用中药，性苦微寒，归肝经，具有清热泻火，明目退翳之功效，常用于目赤肿痛、角膜炎、角膜云翳、虹膜睫状体炎、眩晕、皮肤风热瘙痒、疥癣等的治疗[1]。现代研究表明，青葙子主要的活性成分为五环三萜及其苷类（青葙子苷A、青葙子苷B、齐墩果酸等）、谷甾醇、棕榈酸、豆甾醇等[2]。青葙子苷A具有良好的保肝、抗氧化及抗肿瘤功能[3-5]。急性出血性坏死性胰腺炎（AHNP）是一种级联炎症反应，起病急，病情凶险，发展快，且多合并心、肺、肾、肝等多脏器的功能不全甚至衰竭，病死率高，肝脏是最常受累的器官之一[6]。本试验通过对比观察牛磺胆酸钠（TAC）诱导的大鼠AHNP模型以及使用青葙子苷A治疗后模型中细胞核转录因子（NF-кB）、血清淀粉酶（AMY）、肝组织中TNF-α及腹水量的变化，初步探讨了青葙苷A对AHNP合并肝损伤的治疗作用及机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物与主要试剂

雄性SD大鼠50只购自江西中医学院实验动物中心，体重200～250 g，合格证号：2013016。奥曲肽注射液，诺华制药公司；NF-κB（P65）转录因子分析试剂盒，普洛麦格（北京）生物技术有限公司；Trizol液，Progema公司（中国，香港）；青葙子苷A，南昌万特生物制品有限公司，批号：WT20120931。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 青葙子苷A受试溶液配制：用20倍稀释的DMSO溶液配制成1 mg/mL注射液备用。动物分组：50只雄性SD大鼠随机均分为5组，每组10只。①假手术对照组（A组）；②AHNP生理盐水对照组（B组）；③AHNP+青葙子苷A高、低剂量治疗组（C、D组）；④AHNP+奥曲肽治疗组（E组）。除A组外的40只大鼠采用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射复制AHNP试验模型，剂量为5%的牛磺胆酸钠0.1 mL/100 g，持续1 min，滞留4 min。手术后2、5、8、11 h，奥曲肽治疗组分次背部皮下注射奥曲肽注射液（100 μg/100 mL），剂量为15 μg/kg体重；青葙子苷A治疗组分别注射高剂量（5.0 mg/kg体重，C组）、低剂量（2.5 mg/kg体重，D组）青葙子苷A溶液；AHNP生理盐水对照组（B组）注射等体积生理盐水。A组开腹翻动肠管后关腹造成简单的外科损伤，B、C、D、E组大鼠于注射完药物6 h后，留取静脉血和肝标本待测。

1.2.2 生化指标检测 ①碘-淀粉比色法测定各组大鼠血清淀粉酶含量；②ELISA法测定各组大鼠肝组织中TNF-α含量；③测定各组大鼠腹水量（mL）。

1.2.3 苏木精-伊红染色 取大鼠部分肝组织固定于4%甲醛中，石蜡包埋，切片，HE染色，观察肝组织病理变化。

1.2.4 透射电镜观察卵圆细胞 固定于4%戊二醛中的肝组织常规环氧树脂Epon618包埋，电镜下观察增生的卵圆细胞形态变化。

1.2.5 Western-Blot检测试验各组NF-кB蛋白表达水平 用BCA法进行细胞总蛋白浓度定量，取50 μg总蛋白用10%或6% SDS-PAGE电泳分离，半干法或湿转法电转移至NC膜上，5%脱脂牛奶4 ℃封闭过夜。分别用一抗NF-кB抗体4 ℃孵育过夜；HRP标记的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育1 h，化学发光法显影，β-actin为内参照，以目的蛋白与内参照的灰度比值为结果，用凝胶成像系统进行分析。

1.2.6 统计学处理 试验数据以平均数±标准差表示。采用SPSS11.0统计软件包进行t检验及方差分析，以P<0.05为差异有显著意义。

2 结果与分析

2.1 血清淀粉酶含量、肝组织TNF-α含量及腹水量的变化

由表1可见，B组淀粉酶和TNF-α含量均极显著高于A组（P<0.01）。C、D、E组淀粉酶及TNF-α含量均显著或极显著（P<0.05或P<0.01）低于B组，但仍明显高于A组。试验各组腹水量比较，A组大鼠未见腹水积聚，B组大鼠术后6 h腹水量较多，C、D、E组大鼠6 h腹水量较B组明显减少。

2.2 肝组织HE病理切片

由图1可见，A组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞排列整齐，肝细胞形态正常。B组大鼠肝细胞气泡样变性，肝细胞边界不清，胞浆呈颗粒状；部分大鼠肝组织汇管区内可见炎性细胞浸润，小叶周边的肝细胞发生嗜酸性变性，并可见浓缩的凋亡小体。C、D、E组大鼠肝组织病变较B组明显减轻。

2.3 电镜观察试验各组大鼠卵圆细胞生长变化情况

肝细胞与卵圆细胞比较在形态、超微结构方面存在显著区别：①卵圆细胞呈圆形或椭圆形而肝细胞呈多边形；②卵圆细胞体积较小，约为肝细胞的1/3～l/5；③卵圆细胞核大，嗜碱性强，胞质少，核浆比例较大。病理状态下显示：轻度肝损伤可见卵圆细胞沿汇管区胆管上皮依次排列有序生长；随着损伤加重，卵圆细胞增生由汇管区伸入肝小叶，与肝细胞混杂生长。由图2可见，A组卵圆细胞生长速度较快且排列整齐；B组的生长速度明显较A组慢且排列无规律，与肝细胞混杂生长，部分细胞出现水肿坏死；C、D、E组卵圆细胞与B组相比明显排列有序并且生长速度明显增快。endprint

2.4 试验各组NF-кB蛋白表达的变化

由图3、图4可见，A组NF-кB少量表达；B组NF-кB蛋白表达较A组显著（P<0.05）升高；C、D组NF-кB蛋白表达较B组显著降低（P<0.05），但仍高于A组的表达；E组NF-кB蛋白表达与B组相比有所降低，但无显著差异。

3 小结与讨论

本研究采用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射复制AHNP大鼠模型，病理组织切片结果表明，当AHNP发生时可诱导肝细胞气泡样变性，肝细胞边界不清，胞浆呈颗粒状，部分大鼠肝组织汇管区内可见炎性细胞浸润，小叶周边的肝细胞发生嗜酸性变性，并可见浓缩的凋亡小体；透射电镜观察肝损伤可见卵圆细胞沿汇管区胆管上皮依次排列有序生长，随着损伤加重，卵圆细胞增生由汇管区伸入肝小叶，与肝细胞混杂生长，经过青葙子苷A治疗后卵圆细胞生长较AHNP模型组明显排列有序且生长速度明显增快，并且比色法测定试验各组的血清淀粉酶含量、ELISA法测定肝组织中TNF-α含量及腹水量检测结果也表明青葙子苷A能明显减轻AHNP诱导的肝组织损伤。大量研究表明，AHNP时多器官功能不全（MODS）和全身炎性反应综合征（SIRS）与白细胞过度活化和炎性细胞因子大量释放密切相关，但对于其上游途径即AHNP时如何导致炎性细胞因子释放与白细胞活化则仍不清楚。目前认为，胰酶的过早激活对于AHNP的发病是最直接的因素。胰弹性蛋白酶在胰腺外炎性细胞因子的产生过程中起主要作用，在胰腺的局部炎症与胰外器官损害全身炎症反应的发生之间起重要的作用[7]。近来研究表明，NF-кB是广泛存在于细胞中具有多种转录调节作用的核转录因子，它能参与多种炎症细胞因子的过度表达，参与多种疾病过程[8-11]。腹腔内注射胰弹性蛋白酶在30 min内即可激活NF-кB，表明急性胰腺炎（AP）病程与NF-кB活化密切相关。本研究运用Western-Blot检测试验各组NF-кB蛋白表达水平，结果表明经过青葙子苷A治疗后能够明显抑制AHNP诱导的肝组织损伤时NF-кB蛋白的表达，但青葙子苷A究竟通过何种途径抑制NF-кB的核活性和转位，其具体机制有待进一步的研究探讨。

参考文献：

[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005.137.

[2] 王 莹，郭美丽，王笑康，等.HPLC-ELSD法测定青葙子中青葙苷A和青葙苷B的含量[J].第二军医大学学报，2007，28（11）：1245-1247.

[3] VETRIEHELVAN T，JEGADEESAN M，DEVI B A.Anti-diabetie activity of alcoholic extract of Celosia argentea Linn. seeds in rats[J].Biol Pharm Bull，2002，25（4）：526-528.

[4] 单俊杰，任晋玮，杨 静，等.青葙子提取物降血糖活性的研究[J].中国药学杂志，2005，40（16）：1230-1233.

[5] 陈会敏，张 静，胡志芳，等.熊果酸诱导胃癌细胞BGC-823凋亡机制的研究[J].武汉大学学报（医学版），2006，27（3）：299-302.

[6] 吴之浩，卢根林，邓 勇. 硫化氢对急性出血坏死性胰腺炎患者凝血功能的影响[J].中国乡村医药，2012，23（15）：52-53.

[7] 张 昭，赵 刚，王 丹，等.生长抑素对急性出血坏死性胰腺炎肝损伤的作用机制[J].中国普通外科杂志，2008，17（3）：224-227

[8] TIAN J，YAN J ，WANG W，et al. T-2 toxin enhances catabolic activity of hypertrophic chondrocytes through ROS-NF-kB-HIF-2α pathway[J].Toxicology in Vitro，2012， 26（7）： 1106-1113.

[9] RUSHWORTH S A，BOWLES K M，BARRERA L N，et al.BTK inhibitor ibrutinib is cytotoxic to myeloma and potently enhances bortezomib and lenalidomide activities through NF-Κb[J].Cellular Signalling，2013，25（1）：106-112.

[10] VANDERMARK E R，DELUCA K A，GARDNER C R，et al.Human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins alter NF-kB in cultured cervical epithelial cells and inhibition of NF-kB promotes cell growth and immortalization[J].Virology，2012，425（1）：53-60.

[11] VENKATESWARARAO E，ANH HLE T，SHARMA V K，et al.Study on anti-proliferative effect of benzoxathiole derivatives through inactivation of NF-κB in human cancer cells[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2012，22（14）：4523-4527.endprint

2.4 试验各组NF-кB蛋白表达的变化

由图3、图4可见，A组NF-кB少量表达；B组NF-кB蛋白表达较A组显著（P<0.05）升高；C、D组NF-кB蛋白表达较B组显著降低（P<0.05），但仍高于A组的表达；E组NF-кB蛋白表达与B组相比有所降低，但无显著差异。

3 小结与讨论

本研究采用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射复制AHNP大鼠模型，病理组织切片结果表明，当AHNP发生时可诱导肝细胞气泡样变性，肝细胞边界不清，胞浆呈颗粒状，部分大鼠肝组织汇管区内可见炎性细胞浸润，小叶周边的肝细胞发生嗜酸性变性，并可见浓缩的凋亡小体；透射电镜观察肝损伤可见卵圆细胞沿汇管区胆管上皮依次排列有序生长，随着损伤加重，卵圆细胞增生由汇管区伸入肝小叶，与肝细胞混杂生长，经过青葙子苷A治疗后卵圆细胞生长较AHNP模型组明显排列有序且生长速度明显增快，并且比色法测定试验各组的血清淀粉酶含量、ELISA法测定肝组织中TNF-α含量及腹水量检测结果也表明青葙子苷A能明显减轻AHNP诱导的肝组织损伤。大量研究表明，AHNP时多器官功能不全（MODS）和全身炎性反应综合征（SIRS）与白细胞过度活化和炎性细胞因子大量释放密切相关，但对于其上游途径即AHNP时如何导致炎性细胞因子释放与白细胞活化则仍不清楚。目前认为，胰酶的过早激活对于AHNP的发病是最直接的因素。胰弹性蛋白酶在胰腺外炎性细胞因子的产生过程中起主要作用，在胰腺的局部炎症与胰外器官损害全身炎症反应的发生之间起重要的作用[7]。近来研究表明，NF-кB是广泛存在于细胞中具有多种转录调节作用的核转录因子，它能参与多种炎症细胞因子的过度表达，参与多种疾病过程[8-11]。腹腔内注射胰弹性蛋白酶在30 min内即可激活NF-кB，表明急性胰腺炎（AP）病程与NF-кB活化密切相关。本研究运用Western-Blot检测试验各组NF-кB蛋白表达水平，结果表明经过青葙子苷A治疗后能够明显抑制AHNP诱导的肝组织损伤时NF-кB蛋白的表达，但青葙子苷A究竟通过何种途径抑制NF-кB的核活性和转位，其具体机制有待进一步的研究探讨。

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[11] VENKATESWARARAO E，ANH HLE T，SHARMA V K，et al.Study on anti-proliferative effect of benzoxathiole derivatives through inactivation of NF-κB in human cancer cells[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2012，22（14）：4523-4527.endprint

2.4 试验各组NF-кB蛋白表达的变化

由图3、图4可见，A组NF-кB少量表达；B组NF-кB蛋白表达较A组显著（P<0.05）升高；C、D组NF-кB蛋白表达较B组显著降低（P<0.05），但仍高于A组的表达；E组NF-кB蛋白表达与B组相比有所降低，但无显著差异。

3 小结与讨论

本研究采用牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射复制AHNP大鼠模型，病理组织切片结果表明，当AHNP发生时可诱导肝细胞气泡样变性，肝细胞边界不清，胞浆呈颗粒状，部分大鼠肝组织汇管区内可见炎性细胞浸润，小叶周边的肝细胞发生嗜酸性变性，并可见浓缩的凋亡小体；透射电镜观察肝损伤可见卵圆细胞沿汇管区胆管上皮依次排列有序生长，随着损伤加重，卵圆细胞增生由汇管区伸入肝小叶，与肝细胞混杂生长，经过青葙子苷A治疗后卵圆细胞生长较AHNP模型组明显排列有序且生长速度明显增快，并且比色法测定试验各组的血清淀粉酶含量、ELISA法测定肝组织中TNF-α含量及腹水量检测结果也表明青葙子苷A能明显减轻AHNP诱导的肝组织损伤。大量研究表明，AHNP时多器官功能不全（MODS）和全身炎性反应综合征（SIRS）与白细胞过度活化和炎性细胞因子大量释放密切相关，但对于其上游途径即AHNP时如何导致炎性细胞因子释放与白细胞活化则仍不清楚。目前认为，胰酶的过早激活对于AHNP的发病是最直接的因素。胰弹性蛋白酶在胰腺外炎性细胞因子的产生过程中起主要作用，在胰腺的局部炎症与胰外器官损害全身炎症反应的发生之间起重要的作用[7]。近来研究表明，NF-кB是广泛存在于细胞中具有多种转录调节作用的核转录因子，它能参与多种炎症细胞因子的过度表达，参与多种疾病过程[8-11]。腹腔内注射胰弹性蛋白酶在30 min内即可激活NF-кB，表明急性胰腺炎（AP）病程与NF-кB活化密切相关。本研究运用Western-Blot检测试验各组NF-кB蛋白表达水平，结果表明经过青葙子苷A治疗后能够明显抑制AHNP诱导的肝组织损伤时NF-кB蛋白的表达，但青葙子苷A究竟通过何种途径抑制NF-кB的核活性和转位，其具体机制有待进一步的研究探讨。

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[6] 吴之浩，卢根林，邓 勇. 硫化氢对急性出血坏死性胰腺炎患者凝血功能的影响[J].中国乡村医药，2012，23（15）：52-53.

[7] 张 昭，赵 刚，王 丹，等.生长抑素对急性出血坏死性胰腺炎肝损伤的作用机制[J].中国普通外科杂志，2008，17（3）：224-227

[8] TIAN J，YAN J ，WANG W，et al. T-2 toxin enhances catabolic activity of hypertrophic chondrocytes through ROS-NF-kB-HIF-2α pathway[J].Toxicology in Vitro，2012， 26（7）： 1106-1113.

[9] RUSHWORTH S A，BOWLES K M，BARRERA L N，et al.BTK inhibitor ibrutinib is cytotoxic to myeloma and potently enhances bortezomib and lenalidomide activities through NF-Κb[J].Cellular Signalling，2013，25（1）：106-112.

[10] VANDERMARK E R，DELUCA K A，GARDNER C R，et al.Human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins alter NF-kB in cultured cervical epithelial cells and inhibition of NF-kB promotes cell growth and immortalization[J].Virology，2012，425（1）：53-60.

[11] VENKATESWARARAO E，ANH HLE T，SHARMA V K，et al.Study on anti-proliferative effect of benzoxathiole derivatives through inactivation of NF-κB in human cancer cells[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2012，22（14）：4523-4527.endprint