烟草对常见口腔微生物生长影响的初步研究

季惠惠，刘腾飞，王小 林，鞠 雯，张 平，陈美玲，王 璨，闫珺涵，闫志勇

(1.青岛大学医学院 临床医学系，山东 青岛 266071;2.青岛大学医学院 预防医学系，山东 青岛 266071;3.青岛大学医学院 口腔医学系，山东 青岛 266071;4.青岛大学附属中学，山东 青岛 266071;5.青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛 266071)

近年来，关于吸烟对人体危害的研究越来越深入。研究表明，吸烟可引起多种常见疾病，如肺癌、支气管炎、肺气肿、心血管疾病等［1-2］。此外，口腔是人体富含正常微生物群的部位，口腔微生态环境中微生物的数量和种类很易受外界环境的影响。然而，目前国内外针对香烟对口腔中微生物及相关疾病影响的研究却相对较少，且结果相互矛盾。有研究认为香烟可改变口腔微环境从而有利于微生物的生长，增加口腔白斑及牙周疾病的发病率［3-4］;也有研究认为香烟对口腔微生物没有明显影响［5］，甚至还有研究认为吸烟可促进链球菌等口腔常见细菌的生长［6］。因此，本文采取不同的方法观察香烟对口腔微生物的影响，研究香烟与其生长之间的关系，以客观评价香烟对口腔微生物的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC 25668)、白色假丝酵母(ATCC14053)、草绿色链球菌(自行分离);尼古丁(上海源叶生物科技有限公司)，香烟(泰山宏图，焦油量12 mg，烟气烟碱量 1.1 mg，烟气一氧化碳量 1.2 mg，山东中烟工业有限责任公司生产);营养琼脂、血琼脂平板、磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)、麦氏比浊管(0.5 个单位)等为自行配制。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制备 将上述菌株接种在相应培养基上，分离出单个菌落，分别选取其单个菌落混悬于生理盐水中，稀释至0.5麦氏单位的浊度，备用。

1.2.2 尼古丁对口腔常见微生物的影响 将尼古丁用 PBS 稀释为400、40 μg/mL;取 40 μL 已稀释的菌液置于无菌EP管中，按1∶1的比例分别与 400、40、0 μg/mL 的尼古丁均匀混合，置于恒温震荡器中(37℃，220 r/min)震荡作用6 h，将草绿色链球菌与各浓度尼古丁的混合液按照1∶1000比例进行稀释。同理，大肠埃希菌、金黄色等等球菌、铜绿假单胎菌、白色假丝酵母菌等菌液混合液按照1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶100 比例进行稀释。分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌的稀释液50 μL滴于普通平板中，倾倒适量已高压灭菌的保温60℃的营养琼脂(白色假丝酵母菌用沙保罗琼脂)，轻轻晃动平板使之均匀混合，待其冷却后，置于恒温培养箱内37℃培养24 h;取草绿色链球菌与尼古丁的混合液50 μL置于血平板表面，将菌液涂抹均匀，放置于恒温培养箱内37℃培养48 h。取出上述培养物查看生长情况并进行菌落计数，各菌均设3个重复。

1.2.3 烟草浸出液对口腔微生物的影响 将20支香烟的烟丝取出，置于装有50 mL无菌蒸馏水的洁净离心管内，37℃水浴24 h，5000 r/min离心15 min，取上清液用0.22 μm的滤菌器过滤除菌，然后进行 1∶10、1∶100 稀释，参照 1.2.2 的方法使菌液与烟草浸出液混合作用6 h后，分别采取琼脂稀释法和涂布法进行菌落计数。

1.2.4 烟雾提取物对口腔微生物的影响 将无菌蒸馏水20 mL置于水烟漏斗中，使水烟漏斗的出气口与真空泵相连;取10支已去掉过滤嘴的香烟依次插于水烟漏斗进气口处并点燃，开启真空泵使其燃烧产生的烟雾进入水烟漏斗并溶解于无菌蒸馏水，每只香烟均控制在10 min左右燃烧完。将水烟漏斗中的烟雾水溶液倒入试管中，进行高压蒸汽灭菌。将灭菌后的烟雾水溶液用0.22 μm 的滤菌器过滤除菌，并进行 1∶10、1∶100稀释，参照1.2.2的方法将菌液与烟草浸出液的混合作用6 h后，分别采取琼脂稀释法和涂布法进行菌落计数。

1.2.5 吸烟对志愿者口腔中微生物的影响 召集青岛大学医学院2011级吸烟(平均吸烟10支/d，时间为3 a以上)和不吸烟的男生各25名，清晨待志愿者使用课题组统一提供的牙膏刷牙后，每名志愿者取10 mL生理盐水漱口30 s，分别吐入洁净的无菌纸杯中;取1 mL漱口液置于试管中，然后稀释1000倍，将稀释液各取50 μL涂布血平板表面，放入37℃孵箱培养48 h，观察不同形态的菌落，并通过革兰染色和生化试验对出现频率较高的菌落进行初步鉴定，分别进行计数。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS12.0软件进行，方法为两独立样本资料的t检验，方差不齐时用t'检验。

2 结果与分析

2.1 尼古丁对口腔常见微生物生长的影响

如表1所示，高浓度的尼古丁对口腔微生物有不同程度的抑制作用，低浓度的尼古丁对大肠埃希菌、白色假丝酵母菌作用不明显，对草绿色链球菌生长的抑制作用显著，而对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的生长有一定的促进作用。

表1 不同浓度的尼古丁对口腔常见微生物的影响Table 1 The effects of nicotine in different concentration on the common microbes in the oral cavity

2.2 烟草浸出液对口腔常见微生物生长的影响

如表2所示，高浓度的烟草浸出液对草绿色链球菌、大肠埃希菌有明显的抑制作用，而低浓度有明显的促进作用。不同浓度的烟草浸出液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均有不同程度的抑制作用，且与浓度无相关性。高浓度的烟草浸出液对白色假丝酵母菌有轻微促进作用，低浓度对白色假丝酵母菌有明显的促进作用。

表2 烟草浸出液对口腔中常见微生物的影响Table 2 The effects of tobacco extract in different concentration on the common microbes in the oral cavity

2.3 烟雾提取物对口腔常见微生物的影响

不同浓度的烟雾提取物对实验菌均有抑制作用，且与浓度成正相关，见表3。

表3 烟雾提取物对口腔常见微生物的影响Table 3 The effects of cigarette smoke extract in different concentration on the common microbes in the oral cavity

2.4 吸烟对志愿者口腔漱口液中微生物的影响

如表4所示，吸烟组白色假丝酵母菌的数量高于不吸烟组;吸烟组的草绿色链球菌和葡萄球菌数均显著低于不吸烟组;奈瑟菌数量2组间无明显差异。

表4 志愿者口腔漱口液微生物的比较Table 4 The comparison of the microbes in the oral cavity among the volunteers'mouthwash

3 讨论

吸烟是心血管、呼吸、内分泌等系统疾病的患病危险因素，也可以引起黏膜过角化、白斑、牙周炎、牙龈炎等口腔疾病，因此，人们越来越关注香烟与健康的关系。口腔由于富含营养且与外界相通，是人体正常微生物群含量最多的部位［7］。目前国内尚未见吸烟对口腔中微生物影响的研究报道，国外相关研究也较为少见，且部分研究结果相互矛盾，如Ali等［4］认为烟雾对口腔微生态中的主要细菌的生长有显著抑制作用，Karina等［5］研究认为尼古丁对口腔常见微生物的生长无明显影响作用，而Zonuz AT［6］等类似研究的结论却是吸烟可促进链球菌等口腔常见细菌的生长。因此，为了探讨香烟对口腔微生物的影响及与人类健康的关系，本研究分别检测了尼古丁、烟草浸出液、烟雾提取物对口腔微生物的影响，并比较了吸烟组与非吸烟组志愿者间微生物的差异，以客观评价香烟在口腔疾病等方面的作用。香烟中的主要成分有尼古丁(Nicotine，烟碱)、酚类、醛类、有机酸，而香烟点燃后，不仅包含了烟草中所有的化学成分，同时比烟草本身又增加了一氧化碳和焦油等［8］。本研究分别观察尼古丁纯品、烟草浸出液和烟雾提取物对口腔微生物的影响，根据相关资料计算尼古丁的含量［9］，确定20支香烟浸泡于50 mL蒸馏水制成烟草浸出液。

本研究结果显示，高浓度的尼古丁对细菌有不同程度的抑制作用，低浓度对细菌有不同程度的促进作用，不同浓度的尼古丁对草绿色链球菌均有促进作用;而不同浓度的烟草浸出液对不同的试验菌株的生长的影响不同，不同浓度的烟雾提取物对试验菌株均有明显的抑制作用。高浓度的烟雾提取物对大肠埃希菌、草绿色链球菌、白色假丝酵母菌等部分实验菌有抑制作用，而低浓度有明显促进生长的作用，这可能是由于烟草浸出液中不仅溶有尼古丁，还包括焦油等成分，这些成分在浓度低时能作为碳源、氮源，利于细菌的生长繁殖，而随着浓度升高则显示出对细菌的毒性作用。此外，不同浓度的烟雾提取物对指示菌均有显著的抑制作用;相关研究表明，香烟燃烧释放的烟雾含有3800多种有害成分，因此，烟雾提取物对指示菌的毒性作用大于烟草浸出液。

对志愿者漱口液中微生物的研究结果表明，吸烟一定程度上影响了口腔微生物的种类和数量。男生吸烟组较不吸烟组白色假丝酵母菌的数量有所增加，与烟草浸出液的结果一致，而与尼古丁、烟雾提取物的结果不符，这可能与口腔中pH值和各种酶的影响有关。吸烟组中链球菌及葡萄球菌的数目与不吸烟组相比有所减少，与体外实验结果基本一致，然而上述微生物数量的减少并不意味着疾病感染率的降低，反而可能破坏了口腔菌群的平衡及维持自稳的能力，有可能促使口腔疾病的发生。

综上所述，尼古丁、烟草浸出液、烟雾提取物对口腔常见微生物的影响不同，并与其浓度有关，不同研究材料之间成分的差异也导致了结果的不同;此外，对志愿者的研究表明，香烟对口腔微生物的种类和数量的确有一定的影响。

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［4］Ali Taghavi Zonuz，Ali Rahmati，Hadi Mortazavi，et al.Effect of cigarette smoke exposure on the growth of Streptococcus mutans and Streptococcus sanguis:An in vitro study［J］.Nicotine＆ Tobacco Research，2008，10(1):63-67.

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［6］Zonuz AT，Rahmati A，Mortazavi H，et al.Effect of cigarette smoke exposure on the growth of Streptococcus mutans and Streptococcus sanguis:an in vitro study［J］.Nicotine Tob Res，2008，10(1):63-67.

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