香菇多糖提取方法的研究

石来宝，陈 静，殷 霞

(瑞阳制药有限公司，山东淄博256100)

香菇(Lentinusedodes)为担子菌亚门，担子菌纲，伞菌目，侧耳科。香菇属真菌，因其口味鲜美，香味浓郁，营养丰富，有显著的药用及滋补作用而被誉为“蘑菇皇后”、“抗癌新兵”、“菌中之秀”［1］、“诸菌之冠蔬菜之魁”，它的学名很多，有冬菇、花菇、香草、香信等。香菇不仅是一种美味佳肴，也是一种著名的药用菌。我国历代的医药学家对香菇的药性及功能均有著述，如《日用本草》认为香菇“益气、不饥、治风、破血”［2］。香菇多糖(Lentinan，LNT)是香菇中的重要药用成分，是一种天然人体免疫调节剂，具有抗肿瘤、抗感染和调节免疫力等作用。1969年日本学者千原率先证实了香菇热水提取物的抗肿瘤活性，并对其进行了分析测定，证实此类物质主要是一些高分子多糖(LNT)，它能提高巨噬细胞的吞噬能力，诱导白细胞介素－l(IL－1)和肿瘤坏死因子(TNF)的生成;促进T淋巴细胞增殖，诱导其分泌白细胞介素－2(IL－2);提高B淋巴细胞活性，增加多种抗体的分泌，增强机体的体液免疫调节功能，从而增强机体的抗病能力，并作为优良的免疫调节剂进入临床，国内于1988年引进并实现国产化［3］。羽田、佐木进一步研究证实其有效成分是香菇多糖，CoroChi－hara从香菇子实体中浸提出6种香菇多糖，并证明其中一种具有明显的抗肿瘤作用，定名为Lentinan［4］。另一些香菇中的多糖物质由D－葡萄糖、D－半乳糖、D－甘露糖、L－阿拉伯糖及D－木糖构成。1980年恂二等确认香菇多糖为Th细胞激活剂，它使机体免疫功能得到恢复和提高而杀灭肿瘤细胞，可用于辅助癌症治疗［5］。自此，世界各地掀起了从大型真菌中寻找抗肿瘤药物的热潮，有关香菇多糖的研究尤其活跃。目前，我国已将槐耳制剂(一类新药)、香菇多糖注射液(二类新药)、云芝糖肽胶囊(二类新药)、褐藻多糖硫酸酯、真菌多糖等多糖的研发列入高新技术产品开发的重点支持项目。

香菇多糖是一种以β－D［1→3］葡聚糖残基为主链，侧链为(1→6)葡聚糖残基的葡聚糖［6］。关于香菇多糖的提取研究很多，大致分为酶法提取、酸法提取、碱法提取和水浸提法提取以及微波提取、超声提取。水提醇沉法为最经典的提取香菇多糖的方法，以工艺简单、易于推广等优点为人们所接受。

本研究采用热水浸提法、三氯乙酸浸提法、热水浸提/超声波处理后提取法、超声波处理后/热水浸提提取法从香菇子实体中提取香菇多糖，旨在比较这几种方法的优劣、提高得率、降低成本。

1 仪器与试药

1.1 仪器 FW177型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器公司);紫外可见分光光度计(Spectrumlab 54上海棱光技术有限公司);电子调温电热套(HDM－500，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司);数控超声波清洗器KQ－250DB型，昆山市超声仪器有限公司);离心机(上海安亭科学仪器厂);电热温鼓风干燥箱(山东潍坊集团股份有限公司医疗器械厂);电子分析天平(MP300D，上海恒平科学仪器有限公司);旋转蒸发仪(RE－52A，上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 材料和试药 香菇(市售，55～60℃烘干，粉碎，备用);三氯乙酸(分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司);乙酸(分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司);无水乙醇(分析纯，天津市永大化学试剂开发中心);葡萄糖(分析纯，天津市大茂化学试剂厂);苯酚(分析纯，天津市永大化学试剂开发中心);硫酸(优级纯，天津市化学试剂三厂);乙醚(分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司);溴化十六烷基三甲铵(分析纯，国医药集团上海化学试剂公司);水为去离子水。

2 实验方法与结果

2.1 香菇多糖的提取［7］取香菇子实体放入烘箱内，调温98～100℃烘干、粉碎，过60目筛，备用。

2.1.1 热水浸提法提取 称取香菇粉10 g，置于烧杯中，加200 mL蒸馏水，96℃水浴提取2 h，静置12 h后过滤。收集沉淀再水浴提取两次，过滤，合并3次滤液，浓缩至100 mL，加入200 mL无水乙醇，静置1 d，4 000 rpm离心10 min，沉淀用无水乙醇、乙醚依次洗涤后，自然风干得粗香菇多糖。

2.1.2 三氯乙酸浸提法提取 称取香菇粉10 g，置于烧杯中，加0.2 mol·L－1三氯乙酸(TCA)200 mL，室温浸提12 h，过滤。收集沉淀再提取两次，过滤，合并3次滤液，浓缩至100 mL，加入200 mL无水乙醇，静置1 d，4 000 rpm离心10 min，沉淀用无水乙醇、乙醚依次洗涤后，自然风干得粗香菇多糖。

2.1.3 热水浸提/超声波处理后提取 称取香菇粉10 g，置于烧杯中，加200 mL蒸馏水浸提2 h后，96℃水浴1 h，超声波处理1 h，静置20 h后过滤。收集沉淀再提取两次，过滤，合并3次滤液，浓缩至100 mL，加入200 mL无水乙醇，静置1 d，4 000 rpm离心10 min，沉淀用无水乙醇、乙醚依次洗涤后，自然风干得粗香菇多糖。

2.1.4 超声波处理后/热水浸提法提取 称取香菇粉10 g，置于烧杯中，加200 mL蒸馏水浸提2 h后，超声波处理1 h后96℃水浴1 h，静置20 h，过滤。收集沉淀再提取两次，过滤，合并3次滤液浓缩至100 mL，加入200 mL乙醇，静置1 d，4 000 rpm离心10 min，沉淀用乙醇、乙醚洗涤后，自然风干得粗香菇多糖。

2.2 香菇粗多糖纯化［8］取干燥粗香菇多糖称量后加蒸馏水(W∶V=1∶50)溶解，再加等体积0.15 mol·L－1的溴化十六烷基三甲铵(CTAB)与硼酸－硼砂缓冲液充分混匀，静置，离心，沉淀用2 mol·L－1乙酸溶解，离心，上清液加入等体积乙醇，静置24 h，离心，沉淀用乙醇洗涤两次，冻干即为纯化香菇多糖。

2.3 香菇多糖含量测定

2.3.1 对照品溶液的配制 取葡萄糖约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用水溶解稀释至刻度，即得葡萄糖对照品溶液(100 mg·L－1)。

2.3.2 最大吸收波长的选择［9］采用苯酚－硫酸法测定多糖含量。精密吸取0.6 mL对照品溶液，加蒸馏水至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加入5 mL浓硫酸，振摇5 min，置沸水浴中15 min，然后置水中冷却30 min。同时做空白，在200～800 nm范围内测定吸收度，结果在490 nm处有最大吸收。

2.3.3 线性关系考察 精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖对照品溶液(100 mg·L－1)，加蒸馏水至1.0 mL，加入5%苯酚液1.0 mL摇匀，迅速滴加浓硫酸5 mL，振摇5 min，置沸水浴中15 min，再置水中冷却30 min，在490 nm处测定吸收度。以吸收度(A)为纵坐标，对照品量(C)为横坐标，得回归方程如下:A=0.010 8 C+0.007，r=0.998 7，在(18 ～106 mg·L－1)呈良好的线性关系。

2.3.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液0.6 mL，按“2.3.3”项下分别测定吸光度，RSD为1.95%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取0.6 mL对照品溶液，按“2.3.3”项下每隔30 min测一次吸光度，结果RSD=1.91%(n=5)，表明在3 h内样品稳定。

2.4 不同溶剂和方法提取香菇多糖的结果如表1所示。

表1 不同溶剂与方法提取香菇多糖的结果

实验显示:三氯乙酸浸提干香菇所得粗多糖质量较低，但多糖含量高，究其原因可能为TCA法脱蛋白效果较好，但糖保留率低和存在多糖水解的问题;另外TCA的浓度也对结果产生重要的影响，多糖溶液中蛋白质的脱除率受TCA浓度的影响，同时多糖损失率也受TCA浓度的影响，且蛋白质的脱除率大小与多糖损失率大小呈现对应关系。由于TCA法脱蛋白时反应较为剧烈，当TCA浓度过高时可能会引起多糖结构的破坏，产生不期望的结果。综合考虑蛋白质脱除率、多糖损失率以及TCA可能对多糖造成的影响，这里TCA选择0.1%的用量为佳［10］。干香菇TCA浸提所得粗多糖经纯化处理多糖含量达93.10%，综合分析TCA浸提香菇多糖得率最高。

热水浸提所得粗多糖质量较高，经纯化处理多糖损失较多，纯化处理后多糖含量最高，达93.12%，但纯化多糖的得率较低。

超声波处理/热水浸提及热水浸提/超声波处理所得粗多糖质量均较高，但多糖含量较低，经纯化处理中多糖损失较多，且纯化多糖含量和得率较低。

3 讨论

3.1 香菇原药材的粉碎情况对其多糖的溶出有比较大的影响。如果颗粒过大，则多糖不容易被提取出来，如果粉碎的过细，则比表面积反而减小，也不利于多糖的溶出。香菇颗粒的粒径为2～3 mm时可以得到较多的多糖粗品［11］。

3.2 香菇多糖提取时，加水量要合适，原料/无离子水(W/W)=1∶20 ～1∶25 为好［11］。过少，在没有达到最佳蒸煮时间之前，浸出液已经变得很少，甚至糊锅，从而影响多糖含量;若加水过多，则浸出液过多，不利于以后的分离浓缩。

3.3 蒸煮温度要合适，经研究表明，在96℃条件下蒸煮可以达到较高的多糖得率［11］。温度过低(85℃)，溶剂的渗透能力和溶解能力降低，使多糖不能有效的溶出;温度过高(100℃以上)导致多糖的裂解，使多糖得率大大降低。

3.4 用苯酚－硫酸法测定多糖时，要保持硫酸足够过量，因为该呈色反应是以对多糖的水解和糖醛反应为基础的。

3.5 实验中，分光光度计测定的吸光度数据是否准确，与所用的苯酚有很大的关系。首先苯酚要纯，本实验用的苯酚为我们自行蒸馏配制。另外测定样品用的苯酚和测标准曲线用的苯酚必须是一次配制的，这样测得的数据才具有可信度，才有比较的价值。

3.6 由于真菌体内有水解酶共存，所以必须采用适当的方法破坏或者抑制酶的活性，例如迅速加热干燥、冷冻保存等。

3.7 在多糖的醇沉过程中的醇的浓度对多糖的沉淀析出有较大的影响，一般情况下醇的浓度应该为80%左右。

3.8 超声法提取多糖有较多的优点，可以缩短提取时间，提高工作效率，节省溶剂，提高有效成分的提取率，简化提取操作步骤。另外，超声提取一般是在常温条件下进行，提取全过程无须加热，避免了高温对有效成分的破坏。超声波破碎过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反应，可避免因结构改变产生错误的结论。被浸提的生物活性物质在一定时间内保持不变，生物活性不减，该法适合于某些热敏成分的提取。因此超声技术已经广泛应用于植物有效成分的提取。

在超声法提取中，一种方法是先超声波处理再热水浸提，一种方法是先热水浸提再超声波处理，以比较处理方法的先后对结果是否有影响。根据实验结果可知，先超声波处理再热水浸提效果较先热水浸提再超声波处理要好。

4 结论

本实验采用不同溶剂和方法浸提香菇得到粗多糖，然后采用相同工艺纯化粗多糖，结果表明用三氯乙酸从干香菇中提取香菇多糖，相对于其他溶剂方法提取的多糖纯度好、得率高，香菇三氯乙酸浸提所得粗多糖经纯化处理多糖含量达93.10%。综合分析香菇多糖提取以三氯乙酸浸提效果最佳。

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