烷化剂环磷酰胺和异环磷酰胺对大鼠肝微粒体CYP2C19酶活性的影响

王红梅，张 震，张平平

(1.齐都医院，山东 淄博255400;2.山东省药学会，山东 济南250101;3.山东万杰医学院，山东 淄博255213)

环磷酰胺(CTX)和异环磷酰胺(IFO)为目前临床上常用的烷化剂类抗肿瘤药物，直接破坏DNA结构和功能，属细胞周期非特异性药物［1］。本研究采用奥美拉唑(OMZ)作为测定CYP2C19酶活性的指针，通过测定大鼠体外培养体系中5－羟基奥美拉唑(5－OHOMZ)与奥美拉唑德的浓度比值，反映CYP2C19 酶的活性［2，3］，研究 CTX、IFO 对 CYP2C19酶活性的影响，为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 高效液相色谱系统(日本Shimadzu公司):紫外分光光度计、SCL－10Avp中央控制器、LC－10ATvp高压泵、SIL－10ADvp自动进样器及CLASS－VP 5.0色谱数据工作站;乙腈(色谱纯，天津市西华特种试剂厂，批号:20050818);NADPH(北京拜尔迪生物公司，批号:20060810);奥美拉唑(珠海威尔凯化工有限公司，批号:20060730);磷酸氢二钠(天津北方天医化学试剂厂，批号:20060803);磷酸二氢钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号:20061031);5－羟基奥美拉唑(分析纯，购自Sigma公司);非那西丁(中国生物制品检定所，批号:100113－200302);二氯甲烷(分析纯，南京中山集团公司化工厂，批号:20060115);甲醇(色谱纯，天津市化学试剂三厂，批号:20070125);环磷酰胺及异环磷酰胺(中国药品生物制品检定所，批号分别为:100113－200302、100595－200501)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex C8柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);岛津 Shim － pack C8预柱(4.6 mm ×10 mm，5 μm);流动相为乙腈 －0.02 mol·L－1磷酸(26∶74，V/V)，用前经0.45 μm 微孔滤膜过滤并经超声脱气;检测波长为302 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱温:30 ℃;进样量20 μL。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取奥美拉唑、5－羟基奥美拉唑对照品，分别制成1 000 mg·L－1、1 mg·L－1的储备液，内标物非那西丁制成100 mg·L－1水溶液。

精密称取磷酸氢二钠、磷酸二氢钠;分别制成0.1 mol·L－1、0.02 mol·L－1的磷酸盐培养液及缓冲液。精密称取 NADPH制成100 mmol·L－1的NADPH辅因子溶液。

1.2.3 CYP2C19酶体外培养体系以及活性测定初始的培养体系中包括大鼠肝微粒体蛋白混悬液50 μL(蛋白浓度为 0.5 mg，350 μmol·L－1奥美拉唑溶液 20 μL，药物溶液 20 μL，50 mmol·L－1NADPH 溶液 20 μL，最后加入 0.1 mol·L－1的磷酸盐培养液使其最终体积为1 mL。在涡旋振荡器上混和30 s，在37℃的水浴摇床中反应20 min后，加入2 mL冰冷的二氯甲烷及非那西丁内标20 μL，涡旋混匀30 s(沉淀蛋白，中止反应)，以12 000 rpm离心5 min后，取有机层1 mL，N2气下吹干，加入50 μL流动相溶解，涡旋混匀30 s，以12 000 rpm离心5 min后，吸取上清液20 μL进样分析，同时以不含肝微粒体的平行空白对照实验来消除奥美拉唑自身水解带来的影响。

1.3 统计学处理 采用 Excel 2007和 SPSS 13.0统计软件。结果均用±s表示，组间比较采用配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法专属性 按选定的色谱条件测得的奥美拉唑标准溶液和5－羟基奥美拉唑标准溶液、空白大鼠肝微粒体蛋白、大鼠肝微粒体蛋白样品处理后的色谱见图1、2、3。结果表明，在选定的色谱条件下，大鼠肝微粒体混悬液中的物质不影响奥美拉唑及5－羟基奥美拉唑的测定，且奥美拉唑、5－羟基奥美拉唑和内标峰分离良好。样品中5－羟基奥美拉唑、内标和奥美拉唑的保留时间分别为7.292、11.996、24.674 min。

图1 奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑色谱图

图2 空白大鼠肝微粒体蛋白色谱图

图3 大鼠肝微粒体蛋白样品处理后色谱图

2.2 标准曲线和线性关系 取试管分别加入20 μL奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑对照品系列浓度溶液，然后分别加入0.05 mL大鼠肝微粒体蛋白混悬液，最后加入0.1 mol·L－1的磷酸盐培养液至1mL，使奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑在培养液中的最终浓度分别为:1、3、5、7、9、11、13、15 μmol·L－1和 0.1、0.5、1、2、3、4、5 μg·mL－1，从“加入冰冷的二氯甲烷2 mL”开始，按CYP2C19酶活性测定的处理方法进行操作。分别以测得奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑与内标非那西丁的峰面积之比Y对浓度X(μg·mL－1)进行线性回归，计算直线回归方程，得奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑的标准曲线方程。奥美拉唑:Y=0.054 4X+0.035 5，r=0.999;5 － 羟基奥美拉唑:Y=0.259 5X －0.052 3，r=0.996。

结果表明，在大鼠肝微粒体培养体系中奥美拉唑在1 ～15 μmol·L－1(0.35 ～5.18 μg·mL－1)范围内线性关系良好，5 －羟基奥美拉唑在0.1 ～5 μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.3 最低检测限和最低定量限 在上述色谱条件下，以引起3倍于噪声的被测样品的进样量为最低检测限，奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑分别为15 ng·mL－1和10 ng·mL－1。当信噪比S/N=10时获得最低定量限，结果显示，奥美拉唑的最低定量限为(0.034±0.01)μg·mL－1，5 － 羟基奥美拉唑的最低定量限为(0.025 ±0.01)μg·mL－1。

2.4 精密度考察 在大鼠肝微粒体培养体系中分别加入高、中、低3个不同浓度的奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑对照品溶液，混合均匀，得到最终浓度分别为 1、7、15 μmol·L－1和 1、3、5 μg·mL－1三种不同浓度的奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑样品，按上述“1.2.3”项下方法操作，取上清液 20 μL 进样，所测结果分别代入奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑标准工作曲线中计算浓度，每个浓度一天内重复测5次，计算其日内精密度;每个浓度每天测定一次，连续测定5 d，同样测定结果分别代入奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑标准工作曲线中计算浓度，计算其日间精密度，结果见表1。

表1 奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑的日内和日间精密度(±s，n=5)

表1 奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑的日内和日间精密度(±s，n=5)

对照品 加入浓度(μg·mL －1)日内精密度(μg·mL－1)RSD(%)日间精密度(μg·mL－1)RSD(%)奥美拉唑3.17 5－羟基奥美拉唑17.271 120.897 259.06 16.73 ±3.87 112.22 ±1.58 252.98 ±4.35 3.99 1.70 4.45 16.57 ±3.40 111.66 ±2.35 249.38 ±3.06 3.54 2.55 50 150 250 48.96 ±1.63 144.06 ±4.54 241.31 ±6.45 3.34 3.15 2.67 47.94 ±1.77 144.06 ±4.53 241.31 ±6.48 3.69 3.15 2.67

2.5 回收率试验 在大鼠肝微粒体培养体系中分别加入高、中、低3个不同浓度的奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑对照品溶液，混合均匀，得到最终浓度分别为 1、7、15 μmol·L－1和 1、3、5 μg·mL－1三种不同浓度的奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑样品，按上述“1.2.3”项下方法操作，取上清液 20 μL 进样，所测结果分别代入奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑标准工作曲线中计算浓度，以含药样品经处理后测得的色谱峰面积与相应浓度的对照品溶液直接进样测得的色谱峰面积比作为提取回收率，计算以上3个浓度水平的提取回收率，结果见表2。

2.6 环磷酰胺及异环磷酰胺对大鼠肝粒体CYP2C19酶活性的影响 结果见表3。

表2 奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑的提取回收率(±s，n=5)

表2 奥美拉唑和5－羟基奥美拉唑的提取回收率(±s，n=5)

对照品 加入浓度(μg·mL－1) 提取回收率(%)RSD(%)奥美拉唑17.271 120.897 259.06 95.79 ±4.20 93.45 ±1.86 98.10 ±4.77 4.38 1.99 4.86 5－羟基奥美拉唑50 150 250 96.60 ±3.87 95.36 ±1.72 96.31 ±1.86 4.01 1.80 1.93

表3 环磷酰胺及异环磷酰胺对大鼠CYP2C19酶活性的影响(±s，n=5)

表3 环磷酰胺及异环磷酰胺对大鼠CYP2C19酶活性的影响(±s，n=5)

药物 浓度(mg·L －1)P值 抑制率(%)5－OHOMZ/OMZ不加入环磷酰胺1.06 ±0.01加入环磷酰胺 10 1.20 ±0.04不加异环磷酰胺 0 1.04 ±0.03异环磷酰胺0 0.000 2 20.7 ±3.47 10 1.26 ±0.040.001 12.63 ±6.32

3 讨论

从表3中可以看出，环磷酰胺与异环磷酰胺对CYP2C19酶有显著抑制作用。肿瘤化疗药物通常具有较小的治疗指数，在临床化疗中往往很难预测肿瘤对药物的反应和机体毒性，因此抗肿瘤药物的应用及疗效就受到很大的限制，集中表现为抗肿瘤药物在患者体内的药效和毒性方面存在显著的个体差异［4］。药物代谢酶在抗肿瘤药物的代谢中起着重要作用，对抗肿瘤药的药效及毒性的易感性有重要影响［5，6］。故实现临床给药个体化意义重大。而大多数化疗药物通常按经验给药，很少实行剂量个体化给药。肿瘤细胞对抗肿瘤药物易产生耐药性，其机制可能有多种［7～9］。肿瘤耐药性的产生是多种分子机制共同作用的结果。事实上，药物代谢酶灭活增加也是肿瘤耐药的潜在重要机制［10］。因此研究抗肿瘤药物的代谢性相互作用，也有利于了解抗肿瘤药的耐药性产生机制，为临床合理应用该类药物，减少抗药性的产生提供参考依据。

环磷酰胺与异环磷酰胺是临床常用的氮芥类烷化剂抗肿瘤药，主要用于大肠癌、乳腺癌、前列腺癌等实体瘤及再生障碍性贫血的治疗［11］。现已研究证实，环磷酰胺与异环磷酰胺在体内都主要经肝细胞色素P450代谢，而且均主要通过羟化代谢生成相应的代谢产物。环磷酰胺与异环磷酰胺主要经CYP2B6、CYP2C9、CYP2C19 及 CYP3A4 代谢［12～15］。实验结果表明，环磷酰胺与异环磷酰胺不同程度地抑制CYP2C19酶的活性，环磷酰胺与异环磷酰胺的氧化代谢与奥美拉唑的氧化代谢有一定相关性，两者同时应用会对CYP2C19酶活性产生竞争抑制。故在临床上环磷酰胺或异环磷酰胺与经CYP2C19酶代谢的药物联合时，应注意代谢性相互作用对相关药物疗效的影响。这一研究结果对于环磷酰胺或异环磷酰胺和相关药物的用药个体化具有重要的临床意义。

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