高原地区捕食线虫性真菌的分离与鉴定

张洪波+张春霞+孙亚丽+多杰才旦+康明

摘要：采用玉米琼脂粉培养基对祁连县、共和县和泽库县4个地区的不同土壤样品进行捕食线虫性真菌的分离，并利用藏绵羊马歇尔线虫第3期幼虫诱导真菌捕食器官的产生。结果表明，从祁连县土壤样品中分离到1株捕食线虫性真菌，根据菌丝及捕食器官的形态特征，鉴定为少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）。

关键词：高原地区；捕食线虫性真菌；分离鉴定

中图分类号：S853.32 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0222-02

真菌是一类具有真正细胞核、能产生孢子的微小生物，一般都进行有性繁殖和无性繁殖。捕食线虫性真菌是自然界的宝贵资源，广泛分布于土壤、动物粪便、动植物残体、苔藓及植物根中，营腐生或寄生生活。捕食线虫性真菌在土壤中处于低代谢状态，初期营腐生生长，后期由于营养竞争进入捕食阶段，把线虫作为主要营养来源或作为腐生生活的补充。目前，已发现杀线虫性真菌200多种，可分为3种类型：第1类是捕食线虫性真菌，这类真菌能产生捕食线虫性结构（器官）如黏性菌环（收缩或不收缩）、黏性菌丝、黏性菌网、黏性菌结等^[1]，通过捕食性器官捕获并杀死线虫幼虫^[2-3]，其最大优点是对人和动物安全无害^[4-5]；第2类是内寄生性真菌，这类真菌借助分生孢子来感染线虫，在线虫体内生长形成菌体，消化吸收掉线虫；第3类是包囊体和根瘤线虫寄生性真菌，主要利用营养菌丝来进攻线虫虫卵或雌虫。捕食线虫性真菌在自然界中分布最广泛，其特有的捕食线虫性结构特征明显，较其他2种类型易于在培养基上进行观察、分离和培养。

寄生虫病严重危害着畜牧业的发展，而胃肠道线虫病又是其中一种主要的寄生虫病，分布广、危害大，造成的畜牧业经济损失巨大。目前，对线虫病的防治主要依赖于化学药物。反复使用同一种化学药物易产生抗药性虫株，还会造成动物性食品的药物残留，对人身体健康带来危害，另外，药物代谢的某些有害成分排出家畜体外，也会对环境造成污染。生物防治因其节能、环保、低毒的特点而被人们广泛研究，国内外普遍重视利用杀线虫性真菌对寄生虫性线虫病的防治^[6-8]，其中，利用线虫天敌——捕食线虫性真菌^[9]进行生物防制研究是最多的。近年来，我国在动物寄生虫病的生物防治领域研究取得一定的进展，杨晓野等对捕食线虫性真菌的分离、鉴定及生物防治等进行了大量研究^[2-4]。但是，对于高原地区捕食线虫性真菌的研究及生物防治尚未见报道。现对青海省祁连县、共和县和泽库县3个高原地区的不同土壤样品，开展捕食线虫性真菌的分离和鉴定，为青海省牛羊线虫病的防制提供基础数据，达到生物控制牛羊寄生虫病的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 设备及药品 隔水式恒温培养箱；普通显微镜；搪瓷盘；直径90 mm、高60 mm的玻璃培养皿。琼脂粉（北京奥博星生物技术责任有限公司，批号：20121308）；青霉素（华北制药股份有限公司，批号：s1110609）；盐酸（白银良友化学试剂有限公司，批号：050315）；氢氧化钠（天津市化学试剂三厂，批号：850629）；氯化钠（北京化工厂，批号：821212）；新鲜玉米粉（超市购买）。

1.1.2 玉米粉琼脂培养基（CMA） 称取新鲜玉米粉40 g，加蒸馏水1 000 mL，微火煮沸1 h，补蒸馏水至1 000 mL，多层纱布过滤；取滤液5 mL，加蒸馏水495 mL，调pH值至6.0～6.2，加琼脂粉20 g，经0.68 MPa高压灭菌20 min后倾注于灭菌玻璃培养皿。

1.1.3 玉米粉琼脂单抗培养基（SACMA） 配制方法同玉米粉琼脂培养基，经0.68 MPa高压灭菌20 min后，冷却至50～60 ℃，每1 mL玉米粉培养基中加入青霉素200 IU，混匀后再倾注于灭菌玻璃培养皿中，备用。

1.1.4 土壤样品及绵羊粪便的采集 土壤采于青海省祁连县、共和县、湟源县和泽库县4个地区，共40份土样。其中，祁连县采集10份土样，土质湿润；湟源县采集3份土样，土质较湿润；日月山采集4份土样，土质干燥；青海大学农牧学院动物房依次在树根、圈口、墙根采集3份土样，墙根土质干燥，其他2份土质较湿润；共和县采集10份土样，土质较湿润；泽库县采集10份土样，土质较湿润。线虫幼虫培养物质使用采自青海大学农牧学院试验动物房饲养的绵羊粪便，利用线虫幼虫培养法得到第3期幼虫备用。

1.1.5 分生孢子洗脱液 取蒸馏水500 mL，加入4.5 g NaCl配成生理盐水，分装于250 mL盐水瓶中，经0.68 MPa高压灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 第3期线虫幼虫的培养 取新鲜羊粪，捏碎后加入少量蒸馏水混匀，捏成山丘状，放在大平皿中将平皿盖压紧，加蒸馏水至平皿2/3处，于25～27 ℃通风温箱中培养5～7 d。从绵羊真胃中挑取马歇尔属或奥斯特属线虫雌虫，从子宫中挤出虫卵，置于每平皿加2～4粒盐的蒸馏水中，于 25～27 ℃ 通风温箱中培养7～10 d，每隔2～4 h搅动1次虫卵。

1.2.2 捕食线虫性真菌的分离鉴定 土壤样品以“十”字形撒在玉米粉琼脂平板培养基中，每份土样接种3皿，并在每个玉米粉琼脂平板培养基内加入约50条线虫第3期幼虫；将培养皿置于搪瓷盘內，保持一定湿度，在（20±1） ℃温箱内培养，每周用普通显微镜观察1次，并加1次幼虫，诱导真菌捕食器官；在3～5 d后若出现捕虫现象，利用显微镜（10×、40×）观察并拍摄照片，根据出现捕食线虫的特征性结构菌环及菌网，参照李天飞等资料^[10]进行分类鉴定。

1.2.3 菌株的纯化 对具有捕虫现象的分离菌株，在显微镜下用接种环钩取，接种到玉米粉琼脂培养基上，27 ℃通风温箱培养3～5 d，观察真菌生长情况。endprint

2 结果与分析

2.1 菌株形态学特征

分离菌株的菌丝发达，呈较密集的丝状体，菌丝无色有隔；线虫幼虫存在时，菌丝上形成菌环；分离菌株分生孢子梗细长、无色、直立、不分枝，分生孢子围绕着分生孢子梗轮状排列生长，一般在2轮以上，分生孢子在孢子梗顶部密集成簇状；分生孢子呈倒卵形，形态丰满，无色双胞，双胞分隔处向内收缩，远端（上端）细胞较大，孢子基部（下部）较尖（图1）。

参考文献：

[1]Nansen P，Grnvold J，Henriksen S A，et al. Interactions between the predacious fungus Arthrobotrys oligospora and third-stage larvae of a series of animal-parasitic nematodes[J]. Veterinary Parasitology，1988，26（3/4）：329-337.

[2]杨晓野，杨莲茹，刘珍莲，等. 捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌CIMH1株捕食特性研究[J]. 中国兽医寄生虫病，1999，7（2）：16-19.

[3]杨玉琴，杨晓野，杨莲茹，等. 少孢节丛孢菌的生长特性研究[J]. 中国兽医科技，1998，28（10）：24-25.

[4]杨莲茹，杨晓野，杨玉琴，等. 捕食线虫真菌的分离鉴定[J]. 中国农业大学学报，1998，7（S2）：76-78.

[5]秦泽荣，缪作清，李美子，等. 新鲜牛粪便中食线虫真菌的分离和鉴定[J]. 中国兽医学报，2001，21（1）：58-59.

[6]杨晓野，汪 明，杨连茹，等.寄生虫生物控制概述[J].中国兽医杂志，2003，39（7）：30-32.

[7]Grnvold J，Wolstrup J，Nansen P，et al. Nematode-trapping fungi against parasitic cattle nematodes[J]. Parasitology Today，1993，9（4）：137-140.

[8]Waller P J，Larsen M. The role of nematophagous fungi in the biological control of nematode parasites of livestock[J]. International Journal for Parasitology，1993，23（4）：539-546.

[9]Cooke R C，Godfrey B . A key to the nematode-destroying fungi[J]. Transactions of the British Mycological Society，1964，47（1）：61-74.

[10]李天飞，张克勤，刘杏忠.食线虫菌物分类学[M]. 北京：中国科学技术出版社，2000.endprint

2 结果与分析

2.1 菌株形态学特征

分离菌株的菌丝发达，呈较密集的丝状体，菌丝无色有隔；线虫幼虫存在时，菌丝上形成菌环；分离菌株分生孢子梗细长、无色、直立、不分枝，分生孢子围绕着分生孢子梗轮状排列生长，一般在2轮以上，分生孢子在孢子梗顶部密集成簇状；分生孢子呈倒卵形，形态丰满，无色双胞，双胞分隔处向内收缩，远端（上端）细胞较大，孢子基部（下部）较尖（图1）。

参考文献：

[1]Nansen P，Grnvold J，Henriksen S A，et al. Interactions between the predacious fungus Arthrobotrys oligospora and third-stage larvae of a series of animal-parasitic nematodes[J]. Veterinary Parasitology，1988，26（3/4）：329-337.

[2]杨晓野，杨莲茹，刘珍莲，等. 捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌CIMH1株捕食特性研究[J]. 中国兽医寄生虫病，1999，7（2）：16-19.

[3]杨玉琴，杨晓野，杨莲茹，等. 少孢节丛孢菌的生长特性研究[J]. 中国兽医科技，1998，28（10）：24-25.

[4]杨莲茹，杨晓野，杨玉琴，等. 捕食线虫真菌的分离鉴定[J]. 中国农业大学学报，1998，7（S2）：76-78.

[5]秦泽荣，缪作清，李美子，等. 新鲜牛粪便中食线虫真菌的分离和鉴定[J]. 中国兽医学报，2001，21（1）：58-59.

[6]杨晓野，汪 明，杨连茹，等.寄生虫生物控制概述[J].中国兽医杂志，2003，39（7）：30-32.

[7]Grnvold J，Wolstrup J，Nansen P，et al. Nematode-trapping fungi against parasitic cattle nematodes[J]. Parasitology Today，1993，9（4）：137-140.

[8]Waller P J，Larsen M. The role of nematophagous fungi in the biological control of nematode parasites of livestock[J]. International Journal for Parasitology，1993，23（4）：539-546.

[9]Cooke R C，Godfrey B . A key to the nematode-destroying fungi[J]. Transactions of the British Mycological Society，1964，47（1）：61-74.

[10]李天飞，张克勤，刘杏忠.食线虫菌物分类学[M]. 北京：中国科学技术出版社，2000.endprint

2 结果与分析

2.1 菌株形态学特征

分离菌株的菌丝发达，呈较密集的丝状体，菌丝无色有隔；线虫幼虫存在时，菌丝上形成菌环；分离菌株分生孢子梗细长、无色、直立、不分枝，分生孢子围绕着分生孢子梗轮状排列生长，一般在2轮以上，分生孢子在孢子梗顶部密集成簇状；分生孢子呈倒卵形，形态丰满，无色双胞，双胞分隔处向内收缩，远端（上端）细胞较大，孢子基部（下部）较尖（图1）。

参考文献：

[1]Nansen P，Grnvold J，Henriksen S A，et al. Interactions between the predacious fungus Arthrobotrys oligospora and third-stage larvae of a series of animal-parasitic nematodes[J]. Veterinary Parasitology，1988，26（3/4）：329-337.

[2]杨晓野，杨莲茹，刘珍莲，等. 捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌CIMH1株捕食特性研究[J]. 中国兽医寄生虫病，1999，7（2）：16-19.

[3]杨玉琴，杨晓野，杨莲茹，等. 少孢节丛孢菌的生长特性研究[J]. 中国兽医科技，1998，28（10）：24-25.

[4]杨莲茹，杨晓野，杨玉琴，等. 捕食线虫真菌的分离鉴定[J]. 中国农业大学学报，1998，7（S2）：76-78.

[5]秦泽荣，缪作清，李美子，等. 新鲜牛粪便中食线虫真菌的分离和鉴定[J]. 中国兽医学报，2001，21（1）：58-59.

[6]杨晓野，汪 明，杨连茹，等.寄生虫生物控制概述[J].中国兽医杂志，2003，39（7）：30-32.

[7]Grnvold J，Wolstrup J，Nansen P，et al. Nematode-trapping fungi against parasitic cattle nematodes[J]. Parasitology Today，1993，9（4）：137-140.

[8]Waller P J，Larsen M. The role of nematophagous fungi in the biological control of nematode parasites of livestock[J]. International Journal for Parasitology，1993，23（4）：539-546.

[9]Cooke R C，Godfrey B . A key to the nematode-destroying fungi[J]. Transactions of the British Mycological Society，1964，47（1）：61-74.

[10]李天飞，张克勤，刘杏忠.食线虫菌物分类学[M]. 北京：中国科学技术出版社，2000.endprint