结核分枝杆菌链霉素耐药临床分离株rrs基因突变与其耐药水平相关性研究

陈高瞻，芦 莲，雷 航，马 峻，孙战强，孙庆文，余晓丽，张舒林

(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北武汉 430023;2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200433;3.武汉市医疗救治中心检验科，湖北武汉 430032;4.上海交通大学基础医学院病原生物学教研室，上海 200025)

结核病是一种古老的传染性疾病，由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染病。据世界卫生组织统计表明:每年有约130万人死于结核病，其中98%的死亡病例发生在发展中国家;另外结核分枝杆菌感染者还呈现上升趋势，每年新增结核分枝杆菌感染者约860万［1-2］。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，在发展中国家中结核患病者人数高居第二位。第五次全国结核病流行病学调查获悉链霉素的耐药性有着上升趋势，我国结核分枝杆菌SM耐药率仅次于异烟肼耐药［3］。链霉素耐药的主要原因之一是编码16S rRNA的rrs基因发生突变。有报道显示链霉素耐药株基因突变与“北京基因型”MTB传播密切相关［4］。笔者旨在探讨武汉地区结核分枝杆菌链霉素耐药基因rrs的突变特征，为进一步探讨rrs基因突变和结核分枝杆菌耐链霉素的相关性奠定基础，为本地区耐药株快速诊断提供数据;同时研究武汉地区“北京基因型”菌株的流行趋势以及rrs突变与“北京基因型”相关性。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

84株临床分离株菌株来源于武汉市医疗救治中心，采用结核菌药敏试验方法(比例法)进行药敏试验。收集病人痰液中的结核分枝杆菌阳性菌，经菌种分离鉴定和药敏试验获取84株临床分离株菌株。结核分枝杆菌标准株H37Rv(ATCC27294)来源于中国药品生物制品检验所。

1.2 主要试剂

实验所需琼脂糖选用西班牙琼脂糖Biowest Agarose，Gold View I型核酸染色剂(目录号:G8140-1)购自于Solarbio公司。dNTP购自上海生工，Taq酶购自 Takara公司。DL2000 DNA Marker由CENEray Biotech公司提供。引物rrs-P1和rrs-P2由上海生工生物公司合成。

1.3 菌种分离、鉴定及药敏实验

病人痰标本中加入2倍体积4%NaOH，涡旋振荡2 min后静置15 min，加入PH 6.8的磷酸缓冲液5 mL混匀，3000×g离心15 min去上清液，向沉淀物加入磷酸缓冲液0.5 mL混匀后，接种于改良酸性罗氏固体(L-J)斜面培养基上分离培养;将分离的抗酸杆菌进行硝基苯甲酸(PNB)和噻吩二羧酸肼(TCH)生长试验、28℃生长试验、耐热接触酶试验等试验，进一步鉴定筛选出所需的结核分枝杆菌群。采用绝对浓度法［5］检测结核分枝杆菌药物敏感性和其耐药浓度。

1.4 DNA模板制备

从改良酸性罗氏固体L-J斜面培养基上挑取结核分枝杆菌菌落加入500 μL 1×TE缓冲液中，于55℃下水浴3 h，95℃高温灭活30 min，加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提3次，用高压灭菌过的双蒸水溶解于－20℃保存待用。

1.5 rrs基因PCR和电泳检测

［6］，合成引物。rrs基因上游引物rrs-P1 序列:5＇-CATGCAAGTC-GAACGGAAAGG-3＇，下游引物 rrs-P2序列:5＇-CAGCGTCAGTTACTGCCCAGAG-3＇。PCR扩增的DNA片段长度为696 bp。PCR扩增采用50 μL 的反应体系(1.5 U Taq 酶，10—100 ng 模板 DNA，终浓度200 μmol/L dNTP，0.4 μmol/L rrs-P1 和 rrs-P2，1.5 mmol/L MgCl2)。PCR 程序:94℃预处理5 min;循环94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min。反应完毕后于1%的琼脂糖凝聚电泳检测。

1.6 PCR扩增产物测序与分析

将rrs基因PCR扩增的阳性产物用Omega-PCR产物回收试剂盒回收纯化后测序，DNA序列测定交由上海生工武汉分部完成。测序结果在Genebank中与结核分枝杆菌标准菌株H37Rv比对。

1.7 北京基因型检测

本研究中采用RD105缺失基因检测法进行“北京基因型”的鉴定。引物设计和反应程序参照参考文献［7］，PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出的750 bp左右的DNA片段即为“北京基因型”，扩增出2条或多条带的则为非“北京基因型”菌株。

2 结果与分析

2.1 rrs基因测序结果统计与链霉素耐药水平

84株(包括44株耐链酶素菌株，20株耐其它药物和20株全敏株)临床分离菌株，均增出了696 bp的DNA片段(图1)。据测序结果统计分析显示:44株链霉素耐药菌株中有16(36.4%)株菌株的rrs基因发生突变(表1)。在这16株突变株中存在四种突变类型:9株1401位A→G突变(见图2)(占总菌株10.7%，突变株 56.3%，MIC≥4-8 μg/mL)，6 株514位A→C突变(占总菌株7.1%，突变株37.5%，MIC≥2-8μg/mL)，1487位 G→A 点突变(MIC=8μg/mL)各1株。20株对链霉素敏感但耐其它药物的菌株中，1株1401位A→G突变，1株514位A→C突变。20株全敏株中，1株1029位点C→T点突变。

图1 rrs基因PCR产物电泳检测情况

图2 临床分离菌株WH40菌株rrs基因1401位点突变情况

表1 耐链霉素临床分离株的rrs突变结果及北京基因型统计(n=44)

2.2 北京基因型检测结果统计

本研究中84株菌株经RD105缺失基因检测，所有“北京基因型”菌株均扩增出单一条带，非“北京基因型”均扩增出了非特异性条带。有77株PCR扩增出了750 bpDNA片段鉴定为“北京基因型”菌株，占全部菌株的91.7%;非“北京基因型”有7株，其中有2株为全敏菌株(表2)。“北京基因型”鉴定结果显示:在武汉地区流行的结核分枝杆菌主要为“北京基因型”。在44株链霉素耐药菌株中，“北京基因型”占40株(90.9%)，且16株突变菌株15株为“北京基因型”(表1)。其中链霉素耐药菌株中，“北京基因型”菌株突变比为93.8%(15/16)高于非“北京基因型”菌株25%(1/4)。44株链霉素耐药MTB中，主要突变类型为A514C和A1401G，二者与“北京基因型”没有显著地相关性(P=1.00 ＞0.05;P=0.94 ＞0.05)。

表2 结核分枝杆菌临床分离菌株耐药表型及北京基因型鉴定结果(n=84)

3 讨论

链霉素是最早用于结核病治疗的抗生素，是一类氨基糖苷类抗生素。作为治疗结核病的四种一线药物之一，链霉素主要作用于核糖体30S小亚基(由21种核糖体蛋白和16S rRNA组成)，诱导遗传密码的错误，抑制mRNA的转录过程，通过干扰菌体蛋白质合成来发挥抗菌作用［8］。结核分枝杆菌耐链霉素突变菌株是由于其核糖体靶位突变，其中编码16S rRNA的rrs基因是链霉素耐药菌株的主要突变基因之一［9］。

本次研究中的44株耐链霉素菌株的rrs基因突变率高达36.4%(16/44)，比吴雪琼等人报导［10］的结果高，主要由于环境问题日趋严峻，其次也不排除地域差异和实验样本量有限等因素。本次研究中，作为链霉素耐药菌株主要突变基因之一的rrs基因其突变位点主要发生在514和1401位点，且大都伴随链霉素高水平耐药，但是分别有两个514和1401位点突变的菌株发现其链霉素的MIC值小于0.25 μg/mL，这降低了 514 和 1401 位点突变用于链霉素耐药检测的特异性，相似的情况国内也有报道［11-12］，另外有25株链霉素耐药菌株未发生突变，但也有部分出现链霉素高耐，这可能由于结核分枝杆菌SM耐药性还存在其他耐药机制［13］。

本次研究中，“北京基因型”鉴定结果显示:84株临床分离菌株中有77株菌株为“北京基因型”，占所有菌株的91.7%为武汉地区广泛流行的结核分枝杆菌，非“北京基因型”7株，和相关报道［14］的“北京基因型”的结核分枝杆菌具有更强的遗传与传播能力的结果相吻合。其中44株耐药菌株中16株突变菌株有15株为“北京基因型”，说明北京基因型的结合分枝杆菌更容易突变，这也进一步阐明了在当前快速鉴定“北京基因型”结核分枝杆菌的重要性［15-17］。

来自天津、新加坡等地区的报道［4，18］提示链霉素耐药结核分枝杆菌的传播可能与“北京基因型”有关。新加坡的报道显示rpsL基因K43R突变与链霉素耐药结核分枝杆菌的“北京基因型”和非“北京基因型”有显著差异，而王撷秀等人的结果却是相反的。本研究中，rrs的主要突变的514和1401位点突变与“北京基因型”没有显著地相关性。证明了不同地区的北京基因型链霉素耐药株的传播机制不尽相同。

综上所述，结核分枝杆菌rrs基因突变和链霉素高水平耐药性相关，突变类型以A514C，A1401G为主，突变频率偏高，故通过rrs基因可以作为检测中部地区结核分枝杆菌耐链霉素菌株的靶基因。结核分枝杆菌“北京基因型”菌株的传播类型和鉴定应当引起相关部门重视。rrs基因突变和“北京基因型”相关性分析为了解“北京基因型”菌株潜在的传播机制提供了重要的参考。

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